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降解對硝基苯胺的混合培養(yǎng)微生物
摘要：通過富集培養(yǎng)，獲得了降解對硝基苯胺的混合培養(yǎng)微生物。結(jié)果表明，對硝基苯胺降解速度和混合培養(yǎng)微生物生長對外加碳源有較強(qiáng)的依賴性。在培養(yǎng)液中添加1•0 g/L葡萄糖和1•0 g/L酵母粉，36 h內(nèi)對硝基苯胺去除率可達(dá)97%以上，對硝基苯胺降解速率可達(dá)4•1 mg/L•h;當(dāng)對硝基苯胺作為培養(yǎng)液生長的唯一碳源、氮源和能源時(shí)，96 h內(nèi)對硝基苯胺去除率為34•8%，降解速率為0•15 mg/L•h。
關(guān)鍵詞：對硝基苯胺;生物降解;混合培養(yǎng);純培養(yǎng)
1、引言
硝基苯胺(NA)的3種異構(gòu)體:鄰硝基苯胺、間硝基苯胺、對硝基苯胺，是印染、橡膠、制藥、塑料和油漆等行業(yè)的重要原料，是染料工業(yè)的中間體。這3種化合物可通過呼吸道、消化道而攝入體內(nèi)，使氧和血紅蛋白變?yōu)楦哞F血紅蛋白，影響組織細(xì)胞供氧而造成內(nèi)窒息，且被認(rèn)為對人體有很強(qiáng)的致癌性[1]。苯胺類化合物對環(huán)境的污染一直被人們所關(guān)注，我國把苯胺類化合物列入環(huán)境中的重點(diǎn)污染物，并制定最高容許排放濃度5 mg/L。
此類化工廢水治理較為困難，國內(nèi)研究較少，至今為止絕大多數(shù)采用物理[2，3]、化學(xué)[4~6]的方法加以處理，但這些方法處理費(fèi)用偏高，操作要求較為嚴(yán)格，實(shí)際上難以推廣運(yùn)用，因而迫切需要尋找一些行之有效的、費(fèi)用相對低廉的處理方法。本研究以對硝基苯胺為目標(biāo)污染物，通過富集培養(yǎng)某化工廠好氧處理池的污泥，獲得了對該污染物降解效果較好的混合培養(yǎng)微生物，用該微生物作為降解菌源，對對硝基苯胺的生物降解特性進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究。
2、實(shí)驗(yàn)材料與方法
2.1 菌種來源
菌種來自某化工廠廢水處理系統(tǒng)好氧池污泥。
2.2 試驗(yàn)儀器及設(shè)備
恒溫?fù)u床;7500分光光度計(jì);pH計(jì);高速離心機(jī)。
2.3 培養(yǎng)液及微量元素
降解菌培養(yǎng)基
K2HPO4.3H2O 430 mg/L; KH2PO4•7H2O170 mg/L;MgSO4•7H2O22•5 mg/L;CaCl2 27•5 mg/L; NaEDTA 100 mg/L; Na2HPO4•7H2O 668 mg/L。
基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基
KH2PO41 000 mg/L; Na2HPO4•12H2O 7 000 mg/L;檸檬酸鐵40 mg/L; CaCl2•2H2O 100 mg/L; MgSO4•7H2O 300 mg/L; pH7•35。
YPS培養(yǎng)液
酵母粉10 g/L;蛋白胨10 g/L;氯化鈉5 g/L。
微量元素(TMS)
FeCl3•6H2O;ZnCl2•4H2O; CoCl2•2H2O;Na2MoO4•2H2O; CaCl2•2H2O; CuSO4• 5H2O;H3BO4;HCl等。
基礎(chǔ)無機(jī)鹽/TMS/YE培養(yǎng)液 每1 L無機(jī)培養(yǎng)液中添加3 mL微量元素和1 g無菌酵母粉。
2.4 研究內(nèi)容與方法
2.4.1 降解菌的分離
(1)富集培養(yǎng) 菌種馴化過程在30℃的恒溫室中進(jìn)行。首先取5 mL新鮮的活性污泥加入到盛有50 mL YPS培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，在120 r/min 轉(zhuǎn)速下，連續(xù)振蕩培養(yǎng)24 h，然后從中取10%培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的YPS培養(yǎng)液中。在相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，從中取5 mL作為接種菌液，加入到含20 mg/L對硝基苯胺的基礎(chǔ)無機(jī)鹽/TMS/YE培養(yǎng)液中，10 d左右培養(yǎng)液原黃顏色褪去。再取10 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新鮮的含對硝基苯胺基礎(chǔ)無機(jī)鹽/TMS/YE培養(yǎng)液中，2 d后培養(yǎng)液黃顏色也褪去。把此種培養(yǎng)液作為降解試驗(yàn)的接種菌液，菌體的OD值大約1.2 左右，降解特性試驗(yàn)中菌體的接種量為10 mL。
(2)純培養(yǎng) 從降解速率較高的富集培養(yǎng)物中取樣，在含有對硝基苯胺平板上劃線分離，放置于30℃恒溫室內(nèi)培養(yǎng)數(shù)天，觀察菌落生長情況，把形成的耐受力強(qiáng)單菌落挑斜面保存(即為純培養(yǎng)物)。
2.4.2 對硝基苯胺降解特性試驗(yàn)
pH值 對硝基苯胺初始濃度為50 mg/L，調(diào)節(jié)混合培養(yǎng)液初始pH值，置于30℃恒溫室振蕩培養(yǎng)36 h后，以初始培養(yǎng)液為空白參比測定OD值以及對硝基苯胺去除率，確定混合培養(yǎng)微生物生長適宜的pH值范圍。
外加碳源 對硝基苯胺初始濃度約為50 mg/L、100 mg/L，pH值約為7.5，分別添加0、0.5、1.0 g/L葡萄糖條件下，探明微生物能否利用對硝基苯胺作為生長的唯一碳源、氮源和能源，以及不同葡萄糖量對微生物生長及對硝基苯胺去除率的影響。
基質(zhì)濃度 對硝基苯胺初始濃度約為50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L，pH值約為7.5，間隔一定時(shí)間取樣，測定培養(yǎng)液中對硝基苯胺濃度、pH及OD值的變化。通過微生物的生長曲線、基質(zhì)降解曲線等過程來分析該混合培養(yǎng)微生物的基本特性。
2.5 分析項(xiàng)目和測定方法
對硝基苯胺濃度 采用分光光度法[7]，在最大吸收峰(λmax= 360 nm)測定其吸光度�；旌弦航�(jīng)9 000 r/min高速離心5 min，取上清液測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算其濃度。若對硝基苯胺濃度超過10 mg/L均稀釋后測定。
菌體濃度OD值 采用分光光度法，混合液充分搖勻后直接在波長λ=600 nm測定其吸光度。溶液的菌體濃度等于實(shí)際測定的OD值減去空白值(不接菌液)的OD值。
pH值 混合液充分搖勻后直接用pH計(jì)測定。
3、結(jié)果與討論
3.1 pH值對降解的影響
混合培養(yǎng)微生物對硝基苯胺初始濃度約為50 mg/L，在不同初始pH值條件下，經(jīng)30℃恒溫振蕩培養(yǎng)36 h后，其菌體濃度OD值和對硝基苯胺去除率關(guān)系。從圖中可以看出微生物生長適應(yīng)pH值范圍較寬，在初始pH值為6•5~8•5條件下生長均較好。這與國外研究者的研究結(jié)果[7~8]相吻合———能降解硝基苯類化合物的Pseudomonas sp.、Comamonas testosteroni、Bacillas sp.、Acidovorax delafiedii菌屬最適pH值為6.5~8.5，可以說pH值也是影響降解速率的重要因子。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)微生物初始pH值為3.2、3.7時(shí)，其菌體OD值均<0.4，去除率也很低;pH值為3.7時(shí)去除率為19.5%，而pH值為3.2時(shí)幾乎未見有降解。這說明該混合培養(yǎng)微生物中對硝基苯胺降解菌不適宜在較低的p
H值下生長，但仍具有一定的耐酸性。
值得注意是，當(dāng)初始pH值大于8.5，甚至達(dá)到10•2時(shí)，混合液OD值還是比較高，均超過1•2，但對硝基苯胺去除率幾乎為零。這是由于混合液中添加了1•0 g/L葡萄糖和1•0 g/L酵母膏的緣故。葡萄糖作為外加碳源，提供了微生物生長的電子受體，促進(jìn)了非對硝基苯胺降解菌的生長。
3.2 不同碳量對降解的影響
不同碳量對微生物的生長和對硝基苯胺降解速率的影響結(jié)果.混合微生物能利用對硝基苯胺作為生長的唯一氮源，適量的外在碳源對微生物的生長有很大的促進(jìn)作用，混合液的菌體濃度隨外在碳源(葡萄糖)添加量的增加而增大。但混合液中不添加葡萄糖時(shí)，即對硝基苯胺作為微生物生長的唯一碳源、氮源和能源，菌體濃度明顯小于添加外在碳源的混合液，最終OD值只有0.05。
對于不同底物濃度葡萄糖添加量對對硝基苯胺去除率的影響。當(dāng)?shù)孜飳ο趸桨窛舛葹?1 mg/L時(shí)，不添加外在碳源，96 h內(nèi)去除率為34.7%。而添加0.5 g/L葡萄糖外在碳源，前24 h對硝基苯胺降解速率要快于添加1.0 g/L葡萄糖的培養(yǎng)液，24 h之后其降解速率要慢于后者，但最終去除率都能達(dá)到97%左右。從圖4可以看出，當(dāng)?shù)孜飳ο趸桨窛舛葹?3 mg/L左右時(shí)，葡萄糖的添加量越多，對硝基苯胺的降解速率越快，在24 h之后表現(xiàn)的更為明顯，最終的去除率分別為16.8%、72•2%和96.8%。
從以上的分析可以說明對硝基苯胺作為難降解有機(jī)物，并不是混合微生物新陳代謝理想的碳源。有研究表明[9]，此種難降解化合物在被降解之前，往往需要利用一些簡單的碳源�；旌衔⑸锢贸跫壧荚�(葡萄糖)生長，并產(chǎn)生相應(yīng)的誘導(dǎo)酶，從而使對硝基苯胺得到降解。
3.3 不同底物濃度對降解的影響
不同底物濃度對對硝基苯胺去除率的影響。從圖中可以看出，對硝基苯胺降解速率隨著底物濃度的增加而下降。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)(43•03 mg/L)，對硝基苯胺降解速率明顯要高于其它底物濃度較高的培養(yǎng)液。然而當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǔ潭?83•03 mg/L)后，基于高濃度有機(jī)物毒性對酶的抑制作用，降解速率比較緩慢，降解速率也比較相近.
3.4 混合培養(yǎng)與純培養(yǎng)對對硝基苯胺降解效率比較
混合培養(yǎng)對對硝基苯胺的去除率要明顯高于純培養(yǎng)。純培養(yǎng)對對硝基苯胺的最高去除率只有0.07左右，比混合培養(yǎng)97%的去除率要小很多。有研究表明聚乙烯醇(PVA)的生物降解需要混合菌完成[9]，一般是pseudomonas sp.和Alealigenes sp.或2株不同的pseudomonas sp.，它們之間靠一種共生關(guān)系來完成PVA的降解。Murray[10]對Bacteroides cellulosolvens和Clostridium saccharolyticum混合培養(yǎng)分解纖維素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，前者分解纖維素為后者提供生長所需碳源，后者又可利用前者產(chǎn)生的有毒中間產(chǎn)物，消除對前者分解纖維素的反饋抑制。
Mori[11]認(rèn)為，Clostridium Thermohydrosulfurium YM3和C.ThermocellumYM4混合培養(yǎng)降解纖維素效果明顯高于單菌培養(yǎng)，主要原因是2種菌互相提供了對方所需的生長因子。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也可以證明，混合菌對有機(jī)物的去除率要高于單一菌株，但混合菌株之間是以何種關(guān)系促成有機(jī)物的降解有待于進(jìn)一步研究。
4、結(jié)論
通過富集培養(yǎng)某化工廠的活性污泥獲得了降解對硝基苯胺的混合培養(yǎng)微生物，在好氧條件下對硝基苯胺具有較高的降解速率4•1 mg/L•h。實(shí)驗(yàn)確定了該混合培養(yǎng)物的適宜生長條件:pH為6•8~8•5，溫度為30℃左右。該混合培養(yǎng)物能利用對硝基苯胺作為生長的唯一碳源、氮源、能源，但降解速率較慢。適量的外加碳源可以大大的提高對硝基苯胺的降解速率。混合培養(yǎng)微生物的降解速率要明顯的高于純培養(yǎng)的單一菌種，因此尋找高效好氧降解菌，仍是今后研究的一個(gè)重點(diǎn)。
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