磁性納米顆粒在BMSCs中的封裝及其臨床應(yīng)用論文
磁性納米材料指尺度為 1 ~ 100 nm 的磁性材料，目前以鐵系氧化物居多。磁性納米材料通常在磁性納米顆粒表面修飾上多種生物大分子或者靶的配體，這樣就既具備良好的磁導(dǎo)向性，也具有良好的生物相容性或者靶向性，可與多種功能分子如蛋白質(zhì)、核酸和維生素等結(jié)合，實現(xiàn)磁靶向應(yīng)用[1].磁性納米顆粒的應(yīng)用主要見于： 可作為藥物載體，通過外加磁場的作用將藥物靶向定位； 可應(yīng)用于磁共振成像（ MRI） 作為對比造影劑進(jìn)行體內(nèi)示蹤、細(xì)胞篩選、生物分離和基因治療等。Mah 等[2]將攜帶有治療基因的病毒載體包被到磁性載體的表面，當(dāng)磁性載體到達(dá)靶部位時通過體外磁場使其滯留在靶部位，這樣可使病毒較長時間接觸靶組織，從而增加基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)的效率。
1987 年 Friedenstein 等[3]首次從骨髓中分離獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ BMSCs） ,自此 BMSCs 移植在動物實驗和臨床應(yīng)用中得到了重視和發(fā)展。BMSCs 在體外特定的誘導(dǎo)條件下或體內(nèi)特定環(huán)境下可分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、骨髓基質(zhì)、肌腱及韌帶等組織[4].
BMSCs 具有定向遷移至損傷部位進(jìn)行增殖、分化并修復(fù)損傷組織的能力[5].BMSCs 取材容易，對機體損傷小，且體外培養(yǎng)簡單，細(xì)胞擴增速度快，由于自體移植無明顯的免疫排斥反應(yīng)，也不涉及倫理道德問題，具有良好的臨床應(yīng)用前景，因此，目前在組織工程、基因工程等研究中成為理想的種子細(xì)胞，在臨床疾病的治療過程中，對骨骼系統(tǒng)疾病、肝臟纖維化、心臟疾病的治療具有很高的價值[6].
隨著磁性納米材料技術(shù)的發(fā)展與成熟，利用 MRI標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤的研究成為當(dāng)前熱點[7-9].研究者設(shè)想將磁性納米顆粒封裝入 BMSCs,在保證BMSCs 生物活性和分化潛能的前提下，在外加磁場的作用下，可實現(xiàn) BMSCs 在機體內(nèi)的靶向定位，同時因為磁性納米顆�？勺鳛� MRI 的對比增強劑，可以實現(xiàn)BMSCs 的體內(nèi)示蹤，動態(tài)觀察 BMSCs 的遷移和增殖過程，將磁性納米顆粒封裝入 BMSCs,可以充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。
1 磁性納米材料和 BMSCs 的制備方法
1. 1 常見磁性納米材料制備方法
磁性納米材料一般是鐵氧化物，其制備方法通常有干法與濕法。干法是指在比較劇烈的條件下，使鐵的配合物分解以得到鐵的納米材料； 濕法包括空氣氧化法、共沉淀法、微乳液法及熱分解法。目前在有機相中用的最多的是熱分解法，在水相中則為共沉淀法。
熱分解法是指使用高沸點有機溶劑，使鐵的配合物在高溫下分解，經(jīng)過氧化和部分還原得到產(chǎn)物[10]; 而共沉淀法是指在液相中將沉淀劑加入到含有鐵離子和亞鐵離子的溶液中，生成磁性納米顆粒。
1. 2 BMSCs 的制備方法
BMSCs 主要存在于骨髓組織中，具有貼壁生長的特性，通過全骨髓貼壁分離的方法，經(jīng)多次傳代，可以獲得比較純凈的 BMSCs[11].目前制備 BMSCs 的方法主要有流式細(xì)胞儀分離法、免疫磁珠法、貼壁篩選法及密度梯度離心法等[12].其中免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀法制得的細(xì)胞活性低下，操作繁瑣，較少使用。目前應(yīng)用較多的方法是將密度梯度離心法和貼壁篩選法相結(jié)合，即通過離心使成纖維細(xì)胞和其他單核細(xì)胞分離，接種于培養(yǎng)瓶后，利用 BMSCs 的貼壁生長性，獲得足量的 BMSCs[12-14].
2 磁性納米材料對 BMSCs 的影響
2. 1 磁性納米材料進(jìn)入 BMSCs 的過程和方法
多個實驗表明，磁性納米顆粒及細(xì)胞膜表面都帶負(fù)電荷，兩者相互排斥，這使得磁性納米顆粒在自然狀態(tài)并不能有效地被哺乳動物細(xì)胞攝取，標(biāo)記率低，因此為達(dá)到磁性標(biāo)記細(xì)胞的目的，必須通過修飾細(xì)胞，再經(jīng)由吞噬作用、液相胞飲作用、受體介導(dǎo)的吞噬作用和轉(zhuǎn)染作用促進(jìn)細(xì)胞對其攝取。為了將磁性納米顆粒成功導(dǎo)入 BMSCs,目前常用的方法是使用帶正電荷的基團(tuán)包裹納米顆粒，基團(tuán)必須具備生物相容性和可降解性，以避免損傷正常組織。國內(nèi)學(xué)者做了不少相關(guān)工作。于春鵬[6]選用帶正電荷的轉(zhuǎn)染劑多聚賴氨酸（ PLL,0. 75 μg·ml- 1） ,它包裹帶負(fù)電荷的納米顆粒，形成兩者的聚合體，更容易穿越帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。陳鵬等[10]使用葡聚糖包被的磁性納米顆粒與 BMSCs 共培養(yǎng)，封裝好的細(xì)胞增殖和分化能力均與對照組無明顯差異，磁性納米顆粒晶體表面包裹葡聚糖形成的核殼式結(jié)構(gòu)阻止了氧化鐵顆粒水溶進(jìn)程并保護(hù)細(xì)胞不受 Fe 的毒害，是當(dāng)前使用比較廣泛的一種包被磁性納米顆粒的方法。陳瀛[15]用接種了氨（ Fe304-Si02-NH2） 的二氧化硅（ SiO2） 包裹磁性納米顆粒，使得細(xì)胞對磁性納米顆粒的吞噬率大大提高。金旭紅等[16]用硫酸魚精蛋白包裹磁性納米顆粒，可使納米顆粒成功進(jìn)入 BMSCs,同時不影響細(xì)胞活性和分化能力。
雖然包被納米顆粒的方法很多，可以使納米顆粒成功導(dǎo)入 BMSCs,但是包被好的納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的過程和方式尚不清楚，缺乏相關(guān)研究，另外不同研究中納米顆粒的性質(zhì)和形態(tài)也并不統(tǒng)一。至于 BMSCs 攝取磁性納米顆粒的過程是否受外加磁場的影響，也未見相關(guān)報道。
2. 2 適宜的納米顆粒質(zhì)量濃度和共同孵育時間
關(guān)于納米顆粒標(biāo)記 BMSCs 的適宜濃度，多個研究。[10,15,17-18]報道所用納米顆粒的質(zhì)量濃度有所不同。這可能是不同研究使用的納米顆粒直徑和表面包被的修飾物不同，每個實驗室的研究條件也不一樣的原因所致。張瑞平等[19]總結(jié)前人的研究成果得出納米顆粒合適的質(zhì)量濃度是 20 ~50 （ μg Fe） ·ml- 1,此濃度為磁性納米顆粒的理想標(biāo)記濃度，此濃度下 BMSCs 標(biāo)記率高，且納米顆粒的細(xì)胞毒性及其對 BMSCs 的增殖活性影響較小。一般文獻(xiàn)報道中常用的超順磁性納米鐵離子（ SPIO） 標(biāo)記細(xì)胞的濃度通常在 10 ~ 20 μg·ml- 1.最新研究顯示，SPIO 有效標(biāo)記 BMSCs 的最低質(zhì)量濃度為 15 mg·L- 1[20],在 15 mg·L- 1時，SPIO 對BMSCs 標(biāo)記效率較高，且不影響其存活、增殖。但對納米顆粒和 BMSCs 共同孵育的時間基本一致，為18 ~24 h[18-20],時間過短降低了 BMSCs 的標(biāo)記率，時間過長影響細(xì)胞活性。
2. 3 磁性納米顆粒和 BMSCs 結(jié)合物 （ 納米顆粒-BMSCs） 的鑒定方法
多個研究[11-15,17-18]證實，在適宜的濃度范圍內(nèi)，磁性納米材料對 BMSCs 的形態(tài)、生長、遷移、成骨分化能力等無明顯影響，磁性納米材料具有良好的生物相容性。鑒定磁性納米顆粒是否成功標(biāo)記 BMSCs,以及標(biāo)記后 BMSCs 細(xì)胞的活性和分化能力的方法總結(jié)如下。
2. 3. 1 磁性納米顆粒成功標(biāo)記 BMSCs 的鑒定方法
2. 3. 1. 1 普魯士藍(lán)鐵染色 成功標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)部可看到藍(lán)染顆粒，標(biāo)記率 = 藍(lán)染細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。張旭等[17]發(fā)現(xiàn)，磁性納米顆粒進(jìn)入 BMSCs 后主要積聚于細(xì)胞質(zhì)中，可見大量藍(lán)染顆粒，部分聚集成團(tuán)，顆粒分布以核周和靠近細(xì)胞膜處較為明顯，細(xì)胞核中沒有藍(lán)染顆粒。
2. 3. 1. 2 透射電鏡檢查 以正常的 BMSCs 作為對照，成功標(biāo)記的 BMSCs 細(xì)胞質(zhì)中可觀察到高密度電子顆粒，進(jìn)入的納米顆粒越多，高密度顆粒數(shù)量越多。
2. 3. 2 磁性納米顆粒-BMSCs 生長活性的鑒定方法2. 3. 2. 1 臺盼藍(lán)染色法 將納米顆粒-BMSCs 的細(xì)胞懸液與臺盼藍(lán)染色液以 9∶ 1 的比例混勻，靜置3 min,光鏡下計數(shù)，死細(xì)胞為藍(lán)色，活細(xì)胞不著色，以正常的BMSCs 作為對照，計數(shù) 200 個細(xì)胞，計算活細(xì)胞百分比。
2. 3. 2. 2 細(xì)胞計數(shù)試劑盒（ CCK-8） 法 將標(biāo)記磁性納米顆粒的 BMSCs 制成細(xì)胞懸液，外加正常細(xì)胞的空白對照組，按每孔 100 μl 接種于兩塊 96 孔板中，每組每天 3 個復(fù)孔。培養(yǎng) 24 h 后第 1 天測量組每孔加入10 μl CCK-8 溶液，將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，測量標(biāo)本 450 nm 處的吸光度值（ A 值） .根據(jù)公式： 細(xì) 胞 抑 制 率 = （ A實驗組- A陰性對照組） /（ A實驗組-A空白對照組） ×100%,計算納米顆粒對細(xì)胞的抑制率。
2. 3. 2. 3 測量生化指標(biāo)法 乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶，主要存在于機體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞膜的完整性受到破壞時，胞漿內(nèi)的乳酸脫氫酶會溢出，因此測定上清液中的乳酸脫氫酶活性可以很好地反映細(xì)胞膜受損傷的程度，與細(xì)胞死亡數(shù)目成正比[21].另外，也可測量超氧化物歧化酶（ SOD） 的含量來判斷細(xì)胞的活力。超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)正常的代謝產(chǎn)物，SOD 的主要功能是催化超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧，可清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受傷害，因此 SOD 值可反映細(xì)胞抵抗氧化損傷的能力[22].
2. 3. 2. 4 四甲基偶氮唑鹽（ MTT） 比色法[8,15,17,23]將納米顆粒標(biāo)記的 BMSCs 的細(xì)胞懸液接種于 96 孔板，以未標(biāo)記的 BMSCs 作為空白對照，用酶標(biāo)儀在490 nm處側(cè)出 A 值，并與對照組對比。
2. 3. 3 磁性納米顆粒-BMSCs 分化能力的鑒定方法
2. 3. 3. 1 茜素紅染色法[23]在納米顆粒-BMSCs 組和正常 BMSCs 組中均加入成骨誘導(dǎo)液，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，分化的細(xì)胞中間可見圓形與卵圓形鈣化結(jié)節(jié)，茜素紅染色可見桔紅色鈣鹽沉積。
2. 3. 3. 2 測定 BMSCs 細(xì)胞上清液中的堿性磷酸酶活性 對不同時間段納米顆粒-BMSCs 組和正常 BMSCs組上清液按堿性磷酸酶檢測試劑盒操作說明進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測，測定 A 值，計算兩者差異有無統(tǒng)計學(xué)意義。
3 攝取有磁性納米材料 BMSCs 的臨床應(yīng)用
3. 1 骨骼系統(tǒng)
3. 1. 1 椎間盤突出
Sakai 等[24]用綠色熒光蛋白標(biāo)記的自體 BMSCs移植入成年家兔退變髓核中，結(jié)果顯示，植入的細(xì)胞可以增輔并且表達(dá)出一些髓核細(xì)胞的特征性表型，髓核內(nèi)蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的表達(dá)水平明顯上調(diào)，兩者均為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分。Zhang 等[25]將兔同種異體的 BMSCs 注射入兔的椎間盤，與未注射組和注射鹽水組在 1、3、6 個月時分別檢測 mRNA、蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量，結(jié)果顯示注射 BMSCs 組均明顯增加。鮑軍平等[12]以家兔為實驗對象，證實 BMSCs 對椎間盤尚未突出但髓核已改變的椎間盤同樣有效。
3. 1. 2 股骨頭壞死（ ONFH）
ONFH 是骨科常見難治性疾病，早期多用藥物和物理治療，晚期以人工關(guān)節(jié)置換為主，患者病程長、痛苦多、醫(yī)療花費大。BMSCs 具有多向分化能力，移植入體內(nèi)的 BMSCs 分化后可替換已經(jīng)壞死的細(xì)胞，這為ONFH 的治療提供了一種全新的思路和方法。 在ONFH 病例中，BMSCs 的數(shù)量及成骨活性均有明顯的下降[26].對 116 例壞死的股骨頭行髓芯減壓，同時抽取自體骨髓血，體外分離、濃集后植入骨壞死區(qū)域，即通過細(xì)胞移植治療 ONFH,對早期 ONFH 取得優(yōu)良效果[27].孟增東等[13]證實了 SPIO 標(biāo)記的 BMSCs 與未標(biāo)記的 BMSCs 原位移植治療兔 ONFH 有著同樣療效。
3. 2 肝臟
BMSCs 在肝細(xì)胞生長因子的誘導(dǎo)下可以分化為正常肝細(xì)胞，已有報道將自體移植的 BMSCs 用于重型肝炎和晚期肝硬化的治療，取得了良好效果。于春鵬[6]用 PLL 標(biāo)記的.磁性納米顆粒-BMSCs,通過 MRI觀察 BMSCs 在大鼠肝纖維化模型中的定位情況，證實了 BMSCs 在大鼠體內(nèi)可分化為肝細(xì)胞，同時為 BMSCs的增殖分化提供了影像學(xué)支持。
3. 3 其他疾病
張瑞平等[14]證實 BMSCs 移植對家兔急性重癥胰腺炎（ SAP） 有一定治療效果，同時通過 MRI 進(jìn)行了細(xì)胞示蹤，為 SAP 提供了一種新的治療思路和方法。另外，使用不同的磁性納米顆粒標(biāo)記 BMSCs,將標(biāo)記細(xì)胞移植到梗死的心肌內(nèi)進(jìn)行 MRI 在體內(nèi)顯像的研究，證明標(biāo)記細(xì)胞可以在常規(guī)心臟顯影，并與組織學(xué)檢查有良好的一致性[15].這表明 BMSCs 在體內(nèi)可以遷移到心臟，至于是否能順利分化為心肌細(xì)胞，什么時候分化，需要什么條件，未見相關(guān)研究報道。有研究證實BMSCs 可改善足細(xì)胞融合，促進(jìn)足細(xì)胞再生，理論上為治療糖尿病腎病提供了一種新的手段[28].
4 存在的問題和未來的研究趨勢
BMSCs 的研究已經(jīng)持續(xù)了 30 多年，在成功標(biāo)記磁性納米材料后，通過外加磁場和 MRI 技術(shù)的應(yīng)用，BMSCs 的靶向定位和體內(nèi)的遷移、示蹤等問題迎刃而解，實現(xiàn)了對 BMSCs 的動態(tài)觀察。納米材料的引入為BMSCs 研究帶來了飛躍性發(fā)展，但同時也有很多問題仍待解決： （ 1） 該研究仍處于動物試驗階段，缺乏人體試驗的數(shù)據(jù)，應(yīng)用于臨床尚需時日； （ 2） 相關(guān)的機制和作用過程仍不清楚，例如納米顆粒進(jìn)入 BMSCs 的具體過程和作用機理，BMSCs 在體內(nèi)的定向遷移和分化，以及如何人為控制細(xì)胞分化的過程和結(jié)果等； （ 3） 進(jìn)入機體后，BMSCs 的自行分化問題； （ 4） BMSCs 中的磁性納米顆粒隨著細(xì)胞的分裂逐漸減少，漸漸失去靶向性和定位能力，影響長期觀察[24]; （ 5） 引入磁場后，正常的生理活動是否會受影響。未來的研究重點是 BMSCs 的分化過程和機制，具體的分化時機和結(jié)果，若能實現(xiàn)人為控制，將是向臨床應(yīng)用邁出的重要一步。另外，要找到合適的方法，提高磁性納米顆粒對 BMSCs 的封裝效率，滿足可以作為長期定位和示蹤的要求。同時要引入外加磁場，觀察外磁場對納米顆粒對 BMSCs 的顆粒攝取、遷移、分化等行為有何影響，為將來細(xì)胞的靶向定位打下堅實基礎(chǔ)。
5 總結(jié)和展望
醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的最終目的是應(yīng)用于臨床治療。BMSCs 具有多向分化的潛能，是組織工程學(xué)的重要種子細(xì)胞； 磁性納米材料的出現(xiàn)，是生物材料領(lǐng)域的重大突破； 將磁性納米材料封裝入 BMSCs,可以充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢，具有廣闊的發(fā)展前景。目前該項研究尚有一些問題需要解決和優(yōu)化。可以預(yù)見，不遠(yuǎn)的將來，封裝有磁性納米顆粒的 BMSCs 將會大大促進(jìn)組織工程學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，為廣大患者帶來福利。
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