骨缺損使用異種骨治療的瓶頸及展望
骨移植是臨床醫(yī)生治療骨不連、骨缺損以及進(jìn)行關(guān)節(jié)融合的重要手段，以下是小編搜集整理的一篇探究骨缺損使用異種骨治療問題的論文范文，供大家閱讀參考。
自體骨由于具有骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性、成骨性等優(yōu)點(diǎn)是骨移植材料的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其增加患者創(chuàng)傷、加重患者痛苦等促使臨床醫(yī)生尋求替代材料。異種骨作為20世紀(jì)50~60年代興起的骨移植材料，具有來源廣泛、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)且理化特性與人骨質(zhì)類似，具有廣闊的發(fā)展前景。目前困擾骨科醫(yī)生的主要問題為怎樣使異種骨由死骨變活骨，從而使其表現(xiàn)出類似自體骨生物力學(xué)性能。本文就異種骨免疫學(xué)特性、異種骨材料制備及異種骨活化進(jìn)行深入討論。
1異種骨免疫學(xué)特性
異種組織免疫原特性與人體組織免疫原特性差異很大，因此充分掌握異種骨組織免疫學(xué)特點(diǎn)是進(jìn)行異種骨材料研究的必要前提。骨組織中無機(jī)成分主要是碳酸羥基磷灰石，與人骨類似，因此異種骨去除有機(jī)成分后無免疫原性且生物相容性較好。有機(jī)成分主要為膠原蛋白，其中95%為Ⅰ型膠原，一般認(rèn)為在種系間結(jié)構(gòu)組成差異不大，其抗原部分主要為氨基末端區(qū)域，該抗原成分不引發(fā)明顯免疫反應(yīng)，也不影響成骨作用。引發(fā)免疫反應(yīng)的主要成分包括骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等，所有這些細(xì)胞表面均存在MHC-Ⅰ型抗原及α-Gal抗原;MHC-Ⅱ抗原主要存在于骨髓細(xì)胞表面。在異種移植由于種屬間MHC結(jié)構(gòu)差異較大，T細(xì)胞借助于受者的抗原遞呈細(xì)胞，通過間接途徑識(shí)別抗原引發(fā)免疫反應(yīng)。α-Gal抗原是主要存在于靈長目以外哺乳動(dòng)物體內(nèi)的異種抗原，該抗原主要通過與人血清內(nèi)存在的抗α-Gal抗體結(jié)合而引發(fā)體液免疫反應(yīng)[1].盡管目前存在多種去抗原處理方法，但其核心均為破壞上述細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，去除抗原蛋白組分。輕微免疫學(xué)反應(yīng)對(duì)其生物性能無不良影響，而過分追求消除免疫反應(yīng)反而可降低成骨性能，故今后研究方向應(yīng)從單純物種間免疫反應(yīng)差異向免疫反應(yīng)與生物活性方面轉(zhuǎn)變。
2異種骨材料制備
由于種屬間免疫學(xué)差異導(dǎo)致其與人體組織相容性差，直接用于人體引起強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，因此去除抗原物質(zhì)是保證異種骨載體良好性能的前提。
經(jīng)過去抗原處理的異種骨應(yīng)具備以下特點(diǎn)：良好的組織相容性，并隨本體骨組織的長入降解為可吸收組分;具有多孔結(jié)構(gòu)，有利于營養(yǎng)物質(zhì)輸送、組織細(xì)胞的粘附增殖等;具有骨傳導(dǎo)性。為達(dá)到上述目的，研究人員設(shè)計(jì)出多種去抗原處理方法，依據(jù)處理媒介不同主要分為物理方法和化學(xué)方法。
2.1物理方法
目前常用的物理異種骨脫抗原方法包括高溫煅燒和冷凍凍干骨。高溫煅燒主要通過碳化作用破壞骨內(nèi)有機(jī)質(zhì)從而徹底消除其抗原性，煅燒后其主要成分為羥基磷灰石。對(duì)異種骨進(jìn)行高溫處理時(shí)，其成分變化主要經(jīng)歷以下階段：低于200℃時(shí)主要是水分的喪失;200~300℃開始破壞細(xì)胞成分;高于300℃時(shí)膠原及蛋白組分開始燃火;400~900℃時(shí)碳酸磷灰石逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榱u磷灰石，從而引發(fā)骨材料結(jié)晶度等方面的'改變。在300℃煅燒骨組織時(shí)不改變結(jié)晶度及無機(jī)組分，在材料表面形態(tài)及理性特性等方面與人骨類似。有證據(jù)表明在300℃煅燒的BioOss骨材料內(nèi)殘留Ⅰ型膠原及表面氮，這些物質(zhì)可能有利于改善其力學(xué)特性及生物相容性。Rokn等[2]發(fā)現(xiàn)Bio-Oss骨的成骨能力與β-磷酸三鈣相似，但其誘發(fā)的局部組織炎癥反應(yīng)甚至更低且成骨性能更佳。與上述亞高溫處理相比，900℃以上處理異種骨時(shí)，獲得骨材料不含有機(jī)組分因此不需擔(dān)心免疫反應(yīng)的影響，組織成分主要為HA(羥磷灰石)。Pra-manik等[3]研究發(fā)現(xiàn)牛骨在900℃進(jìn)行煅燒時(shí)可獲得納米羥基磷灰石，該晶體材料具有相互交通密集孔從而提升其生物相容性，且物理性能較佳。但是此種方法獲得骨材料只具備骨傳導(dǎo)性，無骨誘導(dǎo)性，且其置入體內(nèi)后能否逐步降解尚需進(jìn)一步研究。
冷凍骨的一般處理溫度為-20℃，在冰結(jié)晶顆粒緩慢形成的過程中通過力學(xué)作用、化學(xué)損傷及酶反應(yīng)而降低骨組織抗原性。該處理方法保留了骨組織中Ⅰ型膠原及BMP等成骨活性成分，與煅燒相比具有物理特性更佳且置入體內(nèi)后誘導(dǎo)成骨作用更強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但是其祛除抗原作用較差，甚至引發(fā)免疫反應(yīng)而影響成骨作用。Andrade等[4]發(fā)現(xiàn)-70℃對(duì)細(xì)胞等抗原成分破壞較-20℃效果更好，但同時(shí)對(duì)膠原蛋白造成損傷程度加重，損害骨組織機(jī)械特性。與之相比，深低溫冷凍后再對(duì)異種骨進(jìn)行脫水處理其祛除抗原作用較為徹底。冷凍后的干燥脫水過程在降低免疫原性的起重要作用，其原理在于脫水過程所伴發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度的增加。凍干骨殘留水分為3%~5%,保存時(shí)間可達(dá)4~5年。凍干異種骨具有生物力學(xué)特性較佳、經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)點(diǎn)。劉玉增等[5]以兔橈骨缺損作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，�?duì)凍干異種凍干與凍干同種骨治療骨缺損效果進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后12周兩組組織學(xué)分析無明顯差異，置入異種骨大部為骨小梁替代，部分動(dòng)物出現(xiàn)部分骨髓組織、髓腔再通。Long等[6]
對(duì)凍干骨進(jìn)行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)尚有少了細(xì)胞組分殘留，T細(xì)胞增殖試驗(yàn)亦證實(shí)其引發(fā)的免疫反應(yīng)較其他處理方式更加強(qiáng)烈。盡管凍干骨物理特性較佳且有骨誘導(dǎo)特性但殘留抗原物質(zhì)較多，因此最好與其他處理方式聯(lián)合應(yīng)用，從而在保持其良好理化特性的同時(shí)最大限度的去除免疫原性。
2.2化學(xué)方法
該法主要利用化學(xué)試劑對(duì)異種骨進(jìn)行脫脂、脫蛋白、脫細(xì)胞以及去除礦物質(zhì)等處理獲得部分脫蛋白骨、完全脫脂脫蛋白骨及脫細(xì)胞骨基質(zhì)等。傳統(tǒng)脫脂方法主要為氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑浸泡，但其脫脂作用不完全且容易殘留從而危害人體健康。超臨界CO2作為一種較為成熟工業(yè)萃取劑最先應(yīng)用于生物工程領(lǐng)域，該物質(zhì)具有類似氣體的擴(kuò)散性及液體的溶解能力，同時(shí)兼具低黏度，低表面張力的特性，使得超臨界流體能夠迅速滲透進(jìn)入微孔隙的物質(zhì)。田家亮等[7]利用超臨界CO2對(duì)豬骨進(jìn)行脫脂處理，發(fā)現(xiàn)脫脂效果優(yōu)于傳統(tǒng)脫脂方法，且保存了骨組織微多孔結(jié)構(gòu)和合適的孔隙率。但是超臨界CO2對(duì)設(shè)備要求高，增加工藝成本，尚難大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。
異種骨脫蛋白媒介包括次氯酸鈉、雙氧水、乙醇等，其中H2O2應(yīng)用最多，其作用機(jī)制為通過強(qiáng)氧化作用使蛋白質(zhì)變性，消除或減弱抗原性。高濃度H2O2浸泡可部分消除異種骨的抗原性，且浸泡時(shí)間越長抗原性消除越徹底，但浸泡時(shí)間增加以及H2O2濃度越高必然會(huì)損害骨組織機(jī)械強(qiáng)度，合適的處理時(shí)間目前較大爭議。高中禮等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)異種骨經(jīng)30%H2O2處理8h為最佳處理時(shí)間可使抗原性降至最低，最大程度地保留生物力學(xué)強(qiáng)度。但同時(shí)利用30%H2O2對(duì)骨組織進(jìn)行脫蛋白處理，發(fā)現(xiàn)12~36h后有機(jī)物含量無明顯改變且細(xì)胞等抗原成分已基本祛除，超過30h對(duì)膠原蛋白及羥基磷灰石破壞加重，推薦處理時(shí)間在12~30h內(nèi)為宜[9].
通過把上述化學(xué)處理劑綜合利用，研究人員探索出了BioCleanse骨組織處理系統(tǒng)：將骨組織沖洗后依次浸乙醇、雙氧水、洗滌劑及清洗液，同時(shí)在正負(fù)壓交替的環(huán)境下進(jìn)行組織震蕩漂洗[10].該技術(shù)首先用于處理同種異體骨，可有效祛除骨中脂肪組織、細(xì)胞成分及其他抗原成分，在祛除抗原成分的同時(shí)可較好的保持理化特性且具有消毒滅菌效果。Katz等[11]以BioCleanse處理的牛骨作為實(shí)驗(yàn)組，以同種異體羊骨作為對(duì)照組，置入羊脛骨缺損模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)BioCleanse處理異種骨所引發(fā)的免疫反應(yīng)與同種異體骨相似，且與受體骨組織融合較佳，周圍組織無明顯纖維化反應(yīng)。目前此類異種骨研究相對(duì)較少，其實(shí)際臨床效果有待進(jìn)一步研究。
3重組異種骨
異種骨在經(jīng)上述脫抗原處理時(shí)，成骨作用相關(guān)的活性成分亦遭到破壞，所制備的異種骨支架近具備骨傳導(dǎo)性能或微弱的骨誘導(dǎo)性能，無成骨性能。單純異種骨材料置入體內(nèi)后依靠兩端骨組織爬行替代，因此需要修復(fù)骨缺損作用緩慢甚至不能修復(fù)。而異種骨支架與成骨活性物質(zhì)或細(xì)胞結(jié)合后可獲得成骨性能，臨床效果得到一定提升。
3.1異種骨與細(xì)胞重組
重組細(xì)胞來源包括胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞等。理論上胚胎干細(xì)胞性能最佳，但社會(huì)倫理問題等使其應(yīng)用受限。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)研究最為充分，其多能干細(xì)胞具有分離培養(yǎng)簡單、體外擴(kuò)增迅速及有向成骨細(xì)胞分化趨勢等優(yōu)點(diǎn)，動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)均證明其與骨支架材料復(fù)合后成骨性能極佳[12].但以下問題限制其在臨床的廣泛應(yīng)用：數(shù)量較少，約100000個(gè)骨髓細(xì)胞中含有1個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;隨體外擴(kuò)增系數(shù)增加成骨性能下降;提取骨髓細(xì)胞時(shí)對(duì)身體局部傷害較大。作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的潛在替代細(xì)胞，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)研究近來逐漸增多。該細(xì)胞在細(xì)胞表面標(biāo)志物、基因表達(dá)序列及分化潛能方面等與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，因此該細(xì)胞可發(fā)揮成骨作用。
Arrigoni等[13]以羥磷灰石做為支架材料與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合用于修復(fù)兔脛骨骨缺損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可明顯改善骨組織產(chǎn)生速度。但骨間充質(zhì)干細(xì)胞及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與支架材料復(fù)合后何者成骨性能更強(qiáng)目前仍未達(dá)成一致。Han等[14]以兔顱骨缺損為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)兩者成骨性能進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者成骨性能相當(dāng)。Niemeyer等[15]以羊脛骨缺損作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)兩者進(jìn)行對(duì)比，得出了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨性能高于脂肪間充質(zhì)細(xì)胞的結(jié)論。
3.2異種骨與骨形態(tài)蛋白重組
骨形態(tài)蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)是由兩相同條肽鏈構(gòu)成的二聚體，包含多個(gè)功能各異的亞型。其中BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP9具有成骨潛能，其成骨作用關(guān)鍵在于誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞向前成骨細(xì)胞分化，BMP是惟一能夠使未分化骨細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的細(xì)胞因子。
Long等[16]將牛松質(zhì)骨與牛骨形態(tài)蛋白組成重組異種骨，對(duì)其分析發(fā)現(xiàn)其具有良好的生物力學(xué)性能和骨誘導(dǎo)性能，且無明顯免疫學(xué)反應(yīng)。但BMP在骨組織中含量極低、提純過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，目前應(yīng)用基因重組技術(shù)進(jìn)行人工合成的rhBMP2和rhBMP7已進(jìn)行商業(yè)化應(yīng)用。Francis等[17]分析55例牙槽骨缺損修補(bǔ)手術(shù)中應(yīng)用BMP重組異種骨與自體髂骨移植的資料，結(jié)果顯示BMP重組異種骨在臨床效果、影像學(xué)表現(xiàn)及術(shù)后感染發(fā)生率方面均優(yōu)于自體髂骨，且由于縮短手術(shù)時(shí)間未增加總體花費(fèi)。
3.3異種骨與PRP重組
血小板可分泌多種促進(jìn)骨生成細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子的兩個(gè)亞分類TGFβ1和TGFβ2、血管內(nèi)皮生長因子以及上皮生長因子等。將新鮮全血經(jīng)分離濃縮后獲得富血小板血漿(plateletrichplasma,PRP)，其血小板濃度可達(dá)全血幾倍至十幾倍，PRP與骨支架材料復(fù)合理論上可以促進(jìn)骨質(zhì)生成。PRP來自自身血液不僅容易獲得制作簡便價(jià)格低廉而且?guī)缀鯖]有安全隱患，并且其中的生長因子等生物活性因子的比例最接近人體，生長因子之間協(xié)同作用最佳[18].但其確切效果尚未取得一致意見。Park等[19]
以兔顱骨缺損為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，將PRP與支架材料植入骨缺損處，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單純植入支架材料的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組骨再生明顯增加。但Yoon等[20]同樣以兔顱骨缺損為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，以Bio-Oss復(fù)合PRP,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)骨生成作用不明顯。S觃nchez等[21]
認(rèn)為PRP(富血小板血漿)只在一個(gè)較小的濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)骨質(zhì)生成作用，即其濃度在1000000/μl效果較佳，低于此濃度時(shí)其促進(jìn)骨生成作用不甚明顯，而濃度過高時(shí)骨生成有抑制作用。
4異種骨血管化
血供是組織獲得氧氣與營養(yǎng)的必須條件，依靠分子擴(kuò)散對(duì)骨營養(yǎng)的供應(yīng)深度在100~200μm,異種骨材料置入體內(nèi)后血管化是其與周圍骨組織融合的起始及關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如僅依靠周圍血管自然長入，對(duì)于單純異種骨置入材料來說無疑會(huì)延長其融合時(shí)間，對(duì)于重組異種骨來說則會(huì)使其臨床效果大大折扣。因此，應(yīng)采取有力措施促進(jìn)異種骨血管化進(jìn)程。
4.1原位異種骨血管化
原位異種骨血管化是指將VEGF、PDGF及EGF等生長因子與異種骨材料復(fù)合后置入體內(nèi)，從而促進(jìn)異種骨血管化進(jìn)程。目前主要有2種方法：將生長因子與異種骨顆粒復(fù)合植入體內(nèi)，此時(shí)生長因子釋放及講解均較快速，起效作用時(shí)間短暫;生長因子包埋如膠囊內(nèi)可達(dá)到長期緩慢釋放的目的。Yoon等[20]利用富血小板纖維蛋白促進(jìn)了局部血管結(jié)構(gòu)的快速生長。與未復(fù)合富血小板纖維蛋白的移植物相比，加入富血小板纖維蛋白后血管化速度及新生骨的生產(chǎn)速度均明顯增加。此外，干細(xì)胞復(fù)合異種骨材料后同樣可以促進(jìn)血管化。殷劍等[22]
將兔自體脂肪干細(xì)胞直接置于植骨周圍，與對(duì)照組相比，CT掃描發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組血供及代謝未見明顯改善。該技術(shù)與其他血管化技術(shù)相比具有操作技術(shù)相對(duì)簡單、可行度高及不對(duì)機(jī)體造成損傷等優(yōu)點(diǎn)，但其血管化由外向內(nèi)，進(jìn)程相對(duì)緩慢。
4.2異位骨血管化
異位血管化將異種骨材料預(yù)先植入體內(nèi)血供豐富的部位如皮下或肌肉內(nèi)，使得局部血管從異種骨骨組織表面長入。楊佩等[23]
將脂肪干細(xì)胞與支架材料復(fù)合后置入鼠股四頭肌肌袋內(nèi)，術(shù)后2、4周進(jìn)行組織學(xué)檢測織發(fā)現(xiàn)支架孔隙中均長入大量血管，并有小動(dòng)脈長入。但此時(shí)血管的生成部位等完全隨機(jī)進(jìn)行不受人為控制，置入骨缺損部位時(shí)血管吻合較為困難。另一種方法是將局部組織內(nèi)血管等包埋入異種骨組織內(nèi)，可選擇動(dòng)脈、靜脈或動(dòng)靜脈回路作為其血供來源。待血管長入異種骨組織后，將此骨與血管一起移植到骨缺損部位。Matsuda等[24]利用脂肪干細(xì)胞與支架材料構(gòu)成組織工程骨，通過中空管道包埋小鼠股動(dòng)靜脈環(huán)路，結(jié)果在數(shù)周后發(fā)現(xiàn)血管網(wǎng)長入支架內(nèi)。盡管該法血管化作用較為理想，但是不可避免的對(duì)局部血供造成破壞，可能引發(fā)缺血、血栓等不良后果。
4.3體外預(yù)血管化
體外預(yù)血管化是利用血管內(nèi)皮細(xì)胞與異種骨材料體外混合培養(yǎng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)后生成新血管。此外血管內(nèi)皮細(xì)胞可促進(jìn)骨先質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，因此對(duì)局部骨組織生產(chǎn)亦有一定促進(jìn)作用。Rouwkema等[25]首次利用骨原細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在骨架材料上培養(yǎng)出血管結(jié)構(gòu)該體系的優(yōu)點(diǎn)在于骨原細(xì)胞可分泌較大量的VEGF,從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化;而內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌IGF-1、BMP-2等骨生成因子促進(jìn)骨原細(xì)胞的生長分化。此外共培養(yǎng)體系內(nèi)還需加入平滑肌細(xì)胞和周皮細(xì)胞，只有上述3種細(xì)胞復(fù)合在一起方能生產(chǎn)有功能的血管結(jié)構(gòu)。經(jīng)過預(yù)血管化后植入體內(nèi)的骨支架材料的血管化速度明顯增加。除血管內(nèi)皮細(xì)胞外，具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞亦可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
Koob等[26]將間皮干細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞與骨支架材料在體外共培養(yǎng)后置入鼠顱骨缺損模型，發(fā)現(xiàn)間皮干細(xì)胞具有穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞形成初始血管結(jié)構(gòu)的作用。體外構(gòu)造血管網(wǎng)是一種非常理想的骨組織工程方法，該方法前景廣闊但難度大，目前尚處于實(shí)驗(yàn)探究階段。
5展望
異種骨材料經(jīng)脫抗原，與細(xì)胞因子重組進(jìn)一步血管化后可在體內(nèi)發(fā)揮優(yōu)異的效果。目前異種骨材料的脫抗原制備已取得了良好成績，短時(shí)期內(nèi)很難取得更大提升;而將異種骨材料重組及置入體內(nèi)后血管化方興未艾，是當(dāng)前研究的突破熱點(diǎn)。綜合利用各種細(xì)胞因子賦予異種骨材料骨誘導(dǎo)性的同時(shí)使其快速再血管化是當(dāng)前研究未曾克服的難點(diǎn)，同樣這也是未來異種骨材料的發(fā)展方向。未來研究重點(diǎn)應(yīng)為異種骨支架與多種細(xì)胞因子及細(xì)胞成分進(jìn)行重組，并協(xié)調(diào)其相互作用以及與機(jī)體局部微環(huán)境的相互作用，使得骨組織再生與血管化協(xié)調(diào)進(jìn)行，最終達(dá)到類似自體骨移植修復(fù)骨缺損的臨床效果。
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