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淺析超濾法對(duì)綠原酸提取率的影響
畢業(yè)論文摘要： 目的 考察超濾法純化金銀花提取液的最佳條件。方法 采用超濾法（分子截留值5 000），采用高效液相色譜法測(cè)定綠原酸的含量，篩選超濾壓力、藥液流速、循環(huán)時(shí)間3個(gè)因素的最佳條件。結(jié)果 壓力控制在0.05～0.07 MPa，循環(huán)流速控制在2 d/s左右，循環(huán)時(shí)間控制在2 h內(nèi)，最終純化液干浸膏中綠原酸高達(dá)44.10 mg/g.。結(jié)論 本法是純化金銀花藥材及其制劑的一種快速有效的方法。
關(guān)鍵詞： 超濾法；金銀花；綠原酸；純化條件
超濾法是20世紀(jì)60年代興起的一項(xiàng)膜分離新技術(shù)。國(guó)內(nèi)已有人將超濾法運(yùn)用到金銀花的提取中，以超濾法與醇沉法相比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示70%醇沉法較超濾法得到的提取物多，但綠原酸得率低，超濾法較水提醇沉法能更有效地保留有效成分［1］。
綠原酸分子量為354.3，采用超濾(分子量截留值5 000)可以除去其中的多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)高速離心后的水提液進(jìn)行超濾，用高效液相色譜法測(cè)定超濾液中綠原酸含量，以確定超濾程度，避免有效成分的損失。
1 儀器與試藥
中空纖維超濾膜實(shí)驗(yàn)室小設(shè)備（北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司）；RB?15蠕動(dòng)泵（天津紡織工學(xué)院膜技術(shù)工程公司機(jī)械廠）；中空纖維超濾柱CLW?003（聚醚砜，50 mm×300 mm，pH值2～13，截留分子量5 000）（北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司）；美國(guó)Agilent1100液相色譜儀系統(tǒng)；AL104型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。
綠原酸對(duì)照品（中國(guó)生物制品檢定所提供，批號(hào)110753－200212），甲醇、乙腈均為色譜純?cè)噭�，磷酸為分析純�(cè)噭�，水為超純水。藥材�?gòu)自江蘇省藥材公司，由中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院生藥學(xué)鑒定室鑒定為忍冬科植物山銀花Lonicera confusa DC.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花科。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 綠原酸含量的測(cè)定
2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在50 ℃真空干燥至恒重的綠原酸對(duì)照品5 mg，置10 mL棕色量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置10 mL棕色量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含綠原酸50 μg)。因綠原酸受熱見(jiàn)光易分解，宜用棕色量瓶貯存并置4 ℃冰箱備用。
2.1.2 色譜條件 色譜柱YMC?Pack ODS柱（250 mm×4.6 mm）；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相：乙腈?0.4%磷酸（體積比13∶87）；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm。
2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對(duì)照品溶液(50.10 μg/mL)1,5,10,20,40 μL分別注入液相色譜儀，以綠原酸對(duì)照品的量為橫坐標(biāo)(x)，以綠原酸峰面積為縱坐標(biāo)(y)，計(jì)算回歸方程為：y=158.69x + 2.1483，r=0.99998。結(jié)果表明綠原酸在0.0501～2.0040 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。
2.1.4 樣品測(cè)定 精密吸取樣品溶液1 mL于10 mL量瓶中，相應(yīng)溶劑定容，搖勻，采用隨行標(biāo)準(zhǔn)法。
2.1.5 供試品溶液的制備 提取液經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，即可。
2.2 超濾儀的使用
2.2.1 初用時(shí)的前期處理
①將超濾組件內(nèi)的保護(hù)液放掉，儲(chǔ)液箱內(nèi)加入清洗水，水壓不超過(guò)0.15 MPa，進(jìn)水通過(guò)超濾組件經(jīng)濃縮液口和超濾液口排出，不得小于10 min。
�、诓捎觅|(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%～0.5%的氫氧化鈉溶液循環(huán)清洗30 min。清洗時(shí)濃縮液口排液量應(yīng)稍大于超濾液口的排液量。
�、壅麴s水清洗超濾組件，至少40 min�！�2.2.2 運(yùn)行 樣品（經(jīng)高速離心后）從料液槽中經(jīng)蠕動(dòng)泵輸入中空纖維超濾柱，其中的大分子雜質(zhì)從濃縮液出口回到原樣品料液槽中，而小分子藥液則在壓力驅(qū)動(dòng)下透過(guò)超濾膜，從中空纖維外腔的透過(guò)液出口流出。如此反復(fù)循環(huán)，直到達(dá)到分離和濃縮要求。超濾過(guò)程中，壓力通過(guò)調(diào)壓閥和蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速來(lái)控制，流量通過(guò)蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)鈕控制。超濾完畢，用蒸餾水等壓沖洗（關(guān)閉超濾液出口）數(shù)次，至達(dá)到要求。
2.2.3 清洗 每次運(yùn)行完畢后，應(yīng)對(duì)整個(gè)超濾系統(tǒng)進(jìn)行清洗：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%～0.5%的NaOH溶液,浸泡2 h，循環(huán)清洗1 h;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%～0.5%的HCl溶液，浸泡2 h，循環(huán)清洗1 h;用純水清洗至排出液pH值為6～7。
洗滌過(guò)程中可正、反向交替洗滌，如果污染較嚴(yán)重則用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的過(guò)氧化氫進(jìn)行清洗。
2.3 超濾條件的確定
在超濾設(shè)備已經(jīng)確定的情況下，可調(diào)整的操作條件主要有操作壓力、溫度、時(shí)間、循環(huán)流速等［2］。
2.3.1 操作壓力的確定 當(dāng)操作壓力較低時(shí)，膜阻可近似為常數(shù)，此時(shí)膜通量與膜兩側(cè)的壓力差成正比，壓力過(guò)低，通量過(guò)低，純化效率低。隨著操作壓力的增加，膜通量增加，純化效率提高。但當(dāng)操作壓力過(guò)高時(shí)，由于膜的結(jié)構(gòu)比較疏松，這樣會(huì)使膜產(chǎn)生壓實(shí)或增厚，其通道變窄，膜阻增大，使溶質(zhì)對(duì)流遷移到膜表面的速度增大，從而部分地或完全地抵消了錯(cuò)流流動(dòng)的剪切力所產(chǎn)生的在膜表面沉淀的溶質(zhì)的遷移，膜通量下降。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出操作壓力對(duì)流速影響的曲線見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，當(dāng)操作壓力在0.05～0.07 MPa時(shí)，濃縮液的流速是最快的。
圖1 操作壓力對(duì)流速的影響（略）
Fig.1 The effect of operation pressure to flow rate
2.3.2 循環(huán)流速的確定 通常操作壓力及溫度一定時(shí)，超濾循環(huán)液流速對(duì)膜通量的影響十分顯著。低流速時(shí)，大分子物質(zhì)趨向于在膜表面沉積，從而增加了濃差極化及凝膠層的形成，此時(shí)濃差極化阻力以及凝膠層的阻力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于膜阻，膜通量主要受濃差極化及凝膠層的控制。
因此，為減少濃差極化及凝膠層的影響，在條件允許的情況下，應(yīng)盡可能地提高循環(huán)流速。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，選取循環(huán)流速 2d/s或偏大一些，見(jiàn)圖2。
2.3.3 循環(huán)時(shí)間的確定 從圖3可看出，隨著時(shí)間的增多，超濾液不斷透過(guò)，濃縮液中大分子雜質(zhì)量也在不斷地提高，2 h之后，濃縮液流速下降迅速。所以為了提高純化效率，節(jié)約操作時(shí)間，延長(zhǎng)設(shè)備使用壽命，超濾2 h即可。
圖2 超濾液流速的確定（略）
Fig.2 Determination of flow rate of ultrafitration
圖3 循環(huán)時(shí)間的確定（略）
Fig.3 Determination of circle time
3 結(jié)果與討論
3.1 本實(shí)驗(yàn)選用分子量截留值為5 000的超濾膜，最終工藝定為超濾設(shè)備壓力控制在0.05～0.07 MPa，循環(huán)流速控制在2 d/s左右，將原藥材100 g，水煎煮后合并提取液，高速離心后，進(jìn)行超濾，收集超濾液。濃縮干燥，測(cè)最終純化后提取物干膏得率為6.12%，其中綠原酸為44.10 mg/g。
3.2 文獻(xiàn)［3,4］報(bào)道超濾法較醇沉法更能有效地保留有效成分,并能提高口服液的穩(wěn)定性和澄明度。文獻(xiàn)報(bào)道中多選用分子量截留值為10 000的超濾膜,綠原酸得率為95.37%［1］。我們發(fā)現(xiàn)藥物中大部分有效成分分子量皆小于5 000,故采用5 000分子量的超濾膜,結(jié)果純化效果更佳，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中藥液雜質(zhì)少，透明度高，因此超濾儀器的清洗及超濾膜的再生也較10 000級(jí)超濾膜簡(jiǎn)單快速,可大大縮短工藝的時(shí)間。最終產(chǎn)品得率高，符合工藝要求。
【參考文獻(xiàn)】
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