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腺病毒介導(dǎo)凋亡素基因?qū)θ四懝馨┘?xì)胞凋亡的研究
畢業(yè)論文【摘要】 目的 探討凋亡素基因轉(zhuǎn)染對(duì)人膽管癌細(xì)胞凋亡的影響，為膽管癌的治療探索新方法。方法 采用含凋亡素基因的重組腺病毒感染膽管癌細(xì)胞株QBC939，在確定其感染復(fù)數(shù)后通過(guò)光鏡、熒光觀察其凋亡情況，同時(shí)通過(guò)TUNEL染色統(tǒng)計(jì)凋亡率。結(jié)果 膽管癌細(xì)胞株QBC939的重組腺病毒的感染復(fù)數(shù)為65，在感染后第3天凋亡素基因能引發(fā)膽管癌細(xì)胞株QBC939的凋亡，并且隨著時(shí)間的推移其作用越明顯，在第7天凋亡率達(dá)到61.9%。結(jié)論 凋亡素能明顯引發(fā)人膽管癌細(xì)胞的凋亡，在膽管癌的治療上具有較大潛力。
【關(guān)鍵詞】 凋亡素基因； 腺病毒載體； 基因治療； 膽管癌
【Abstract】 Objective To study the effect of adenovirus?mediated apoptin gene on apoptosis of human bile duct carcinoma cells and explore new ways to manage bile duct carcinoma. Methods The human bile duct carcinoma cell line QBC939 was transfected by recombinant adenovirus carrying apoptin gene. After the multiplicity of infection was determined successfully, the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939 was observed by light microscopy and fluorescence microscopy and the rate of apoptosis detected by TUNEL stain. Results The value of multiplicity of infection of human bile duct carcinoma cell line QBC939 transfected by recombinant adenovirus was 65. Apoptin gene started to induce the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939 on the 3rd day and the induction function of apoptin gene increased with time. The apoptosis index of human bile duct carcinoma cell line QBC939 reached 61.9% on the 7th day. Conclusion The apoptin gene can obviously induce the apoptosis of human bile duct carcinoma cell line QBC939, and may be a powerful tool to treat cholangiocarcinoma.
【Key words】 Apoptin gene; Adenovirus vector; Gene therapy; Cholangiocarcinoma
凋亡素， 又稱(chēng)Apoptin(apoptosis induction)，是來(lái)源于雞貧血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白質(zhì)。它能引發(fā)1些腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)此作用。這提示凋亡素在腫瘤的治療上具有較大潛力［1］。目前膽管癌的治療效果難盡人意，迫切需要探索新的治療方法。本實(shí)驗(yàn)利用腺病毒為載體轉(zhuǎn)染人膽管癌細(xì)胞株，以觀察凋亡素基因?qū)θ四懝馨┘?xì)胞凋亡的影響程度，以期探索治療膽管癌的新方法。
1 材料與方法
1.1 材料
我們已成功構(gòu)建含凋亡素基因的重組腺病毒載體［2］。不含目的基因的腺病毒載體由第3軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院燒傷研究所賀偉峰提供；人膽管癌細(xì)胞株QBC939由本研究所王曙光建株［3］；Cytospin 3型細(xì)胞離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Shandon公司；TUNEL試劑購(gòu)自德國(guó)Roche公司。
1.2 方法
1.2.1 QBC939細(xì)胞的重組腺病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)的測(cè)定：在6孔板上傳5×105/孔培養(yǎng)QBC939細(xì)胞，細(xì)胞過(guò)夜生長(zhǎng)。將病毒量為6.56×109 pfu/ml的病毒稀釋5倍后分別取2、5、10、25、50 μl(相應(yīng)的病毒量為：2.61×106、6.56×106、1.31×107、3.28×107、6.56×107)加入6孔板中的5孔，第6孔作為對(duì)照。同時(shí)加培養(yǎng)液500 μl，5% CO2、37 ℃條件下孵育。間隔30 min輕輕搖晃數(shù)次，使之與細(xì)胞充分接觸，孵育3 h后加入培養(yǎng)液1500 μl，72 h后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光情況。選取接近100%的細(xì)胞發(fā)熒光的孔所對(duì)應(yīng)的病毒量來(lái)計(jì)算MOI值。公式為MOI=病毒數(shù)/細(xì)胞數(shù)。這樣可確定最佳感染復(fù)數(shù)。
1.2.2 重組腺病毒對(duì)膽管癌細(xì)胞株QBC939的感染： 根據(jù)上1步探索出的最適MOI來(lái)決定病毒的量， 每日通過(guò)熒光顯微鏡觀察并記錄QBC939細(xì)胞的情況。在1、3、5、7 d后分別收集細(xì)胞爬片， 對(duì)于脫落的細(xì)胞采用制成細(xì)胞甩片來(lái)觀察。實(shí)驗(yàn)共分3組， 重組腺病毒組、 空病毒組和空白組(培養(yǎng)液組)。甩片的制作為： 100×g離心10 min， 用PBS洗滌細(xì)胞1次， 然后用4 ml PBS重溶細(xì)胞， 記錄收集的細(xì)胞數(shù)目約為4000個(gè)。將1/10的液體加入與甩片裝置安裝好的玻片上， 1000×g離心10 min后制成細(xì)胞甩片。
1.2.3 人膽管癌細(xì)胞爬片及甩片的TUNEL染色：人膽管癌細(xì)胞爬片和甩片的TUNEL染色嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。同時(shí)計(jì)算凋亡率。公式為：凋亡率(Apoptosis Index,AI)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/500細(xì)胞總數(shù)×100%。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組間分別進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)檢測(cè)均值， 結(jié)果用±s表示。
2 結(jié)果
2.1 膽管癌細(xì)胞株QBC939的最適腺病毒MOI值
我們用不同腺病毒濃度對(duì)應(yīng)MOI分別為5.3、13.1、26.2、65和131。隨著MOI的提高，膽管癌細(xì)胞株的感染率也相應(yīng)提高，但同時(shí)也出現(xiàn)了細(xì)胞脫壁現(xiàn)象的增加。這提示腺病毒的毒性作用也隨之增大。所以最適MOI應(yīng)該是細(xì)胞的感染率較高，同時(shí)細(xì)胞脫落和其對(duì)應(yīng)的毒性作用相對(duì)較低。因此我們確定MOI為65是含凋亡素基因腺病毒的最適感染復(fù)數(shù)值(圖1)。同時(shí)MOI為65所對(duì)應(yīng)的空病毒感染也提示感染率很高，細(xì)胞脫落現(xiàn)象較少。所以我們也將此值作為空病毒的最適感染復(fù)數(shù)值。
A：重組腺病毒組光鏡圖； B：重組腺病毒組熒光圖； C：空病毒組光鏡圖； D：空病毒組熒光圖
圖1 膽管癌細(xì)胞株QBC939的最適腺病毒為65的光鏡和熒光觀察結(jié)果 (×400)
2.2 重組腺病毒感染QBC939細(xì)胞后的變化
我們從膽管癌細(xì)胞株QBC939的光鏡和熒光照片觀察到如下現(xiàn)象：(1)光鏡下，細(xì)胞在感染含凋亡素基因的病毒后第1天可觀察到有少量細(xì)胞脫落，同時(shí)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)感染病毒后的變化：細(xì)胞略腫脹，有少量細(xì)胞融合，但細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞脫落數(shù)增加，細(xì)胞開(kāi)始變小，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)縮小，細(xì)胞巢狀生長(zhǎng)的密度明顯降低。少數(shù)細(xì)胞可明顯觀察到核仁沿核膜排列呈新月?tīng)�。在感染后�?天可觀察到細(xì)胞核變成兩個(gè)核，細(xì)胞變小，有些細(xì)胞已經(jīng)失去正常結(jié)構(gòu)成為碎片樣�？詹《窘M和空白對(duì)照組以上變化不明顯，反而是細(xì)胞密度增加，細(xì)胞脫落數(shù)目較含凋亡素基因的腺病毒明顯減少。(2)熒光下，第4天觀察到大部分細(xì)胞發(fā)出熒光。 這說(shuō)明在第4天腺病毒的感染才達(dá)到高峰。這時(shí)，含凋亡素基因腺病毒感染的細(xì)胞脫落量較空病毒組和空白對(duì)照組大，并且脫落的細(xì)胞也呈現(xiàn)熒光，有些細(xì)胞輪廓明顯變小，熒光強(qiáng)度明顯增加，也有1些細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，變?yōu)樯畹臒晒馑槠�，而空病毒組以上變化不明顯(圖2)。
2.3 腺病毒感染后QBC939細(xì)胞的TUNEL染色及統(tǒng)計(jì)結(jié)果
我們的實(shí)驗(yàn)中膽管癌細(xì)胞含有熒光蛋白，所以采用復(fù)染后封片觀察。其陽(yáng)性結(jié)果是細(xì)胞核染成棕色，而非凋亡細(xì)胞則為藍(lán)色。從圖3可看出，含凋亡素基因的腺病毒感染膽管癌細(xì)胞后出現(xiàn)細(xì)胞核的棕色染色較空病毒組和空白對(duì)照組明顯增多。
從圖4可看出， 隨著時(shí)間的推移， 含凋亡素基因腺病毒感染QBC939細(xì)胞的凋亡率是逐漸增高。從第3天開(kāi)始， 含凋亡素基因的腺病毒組的凋亡率較其他兩組明顯增高。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)， 差異越來(lái)越明顯。這充分說(shuō)明凋亡素基因能引發(fā)膽管癌細(xì)胞株QBC939的凋亡。含凋亡素基因的腺病毒組的凋亡率在第7天可達(dá)61.9%， 而空病毒感染的QBC939細(xì)胞的凋亡率為10.91%， 正常QBC939細(xì)胞的凋亡率為6.89%。顯示正常的膽管癌細(xì)胞是存在凋亡的， 但凋亡率較低。含凋亡素基因的腺病毒引發(fā)QBC939細(xì)胞的凋亡較空病毒組和空白對(duì)照組明顯增高， 表明凋亡素能引發(fā)膽管癌QBC939細(xì)胞的凋亡。
A：重組腺病毒組光鏡圖； B：重組腺病毒組熒光圖； C：空病毒組光鏡圖； D：空病毒組熒光圖
圖2 腺病毒感染QBC939細(xì)胞后7 d的光鏡和熒光觀察結(jié)果 (×400)
A：重組腺病毒組爬片結(jié)果； B：重組腺病毒組甩片結(jié)果； C：空病毒組爬片結(jié)果；
D：空病毒組甩片結(jié)果； E：空白對(duì)照組爬片結(jié)果； F：空白對(duì)照組甩片結(jié)果
圖3 腺病毒感染QBC939細(xì)胞后7 d的染色結(jié)果 (TUNEL ×400)
圖4 腺病毒感染QBC939細(xì)胞后的凋亡率折線圖
3 討論
正常膽管上皮細(xì)胞的更新和凋亡是維持動(dòng)態(tài)平衡的。當(dāng)其受損， 必然會(huì)引發(fā)癌基因和抑癌基因的
突變， 特別是凋亡相關(guān)基因的突變， 使本該凋亡的缺陷細(xì)胞得以生存， 并不斷增殖而可能形成腫瘤。所以膽管癌的發(fā)生、 發(fā)展也是機(jī)體引發(fā)凋亡失敗的結(jié)果。當(dāng)膽管癌形成后由于局部缺血、 基質(zhì)反應(yīng)失控和內(nèi)在凋亡機(jī)制的激活會(huì)出現(xiàn)自發(fā)的凋亡現(xiàn)象［4］。張豐深等［5］發(fā)現(xiàn)膽管癌臨床標(biāo)本的自發(fā)凋亡率約為7.89%， 而且低分化和具有轉(zhuǎn)移潛能的膽管癌細(xì)胞的自發(fā)凋亡率較低。由此判斷自發(fā)凋亡率低的膽管癌細(xì)胞可能具有更多的逃避凋亡的機(jī)制， 因此， 誘發(fā)轉(zhuǎn)化的膽管上皮細(xì)胞和膽管癌細(xì)胞的凋亡在預(yù)防和治療膽管癌以及抑制其轉(zhuǎn)移都具有重要意義。
凋亡素是外來(lái)蛋白，對(duì)多數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞具有促凋亡作用，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)凋亡效應(yīng)和毒副作用。故其在腫瘤的治療上有廣闊的前景［6］。而膽管癌由于本身特殊的生物學(xué)行為，在臨床上明確診斷后往往屬于中晚期，手術(shù)切除率低，復(fù)發(fā)率高，臨床療效難盡人意。所以人們開(kāi)始探索新的治療方法，特別是基因治療，希望能極大提高它的療效［7］。因此我們運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建了含凋亡素基因的腺病毒并轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞株QBC939，考慮到在脫落細(xì)胞中也存在凋亡細(xì)胞，為準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)凋亡率，我們將脫落細(xì)胞制成甩片進(jìn)行染色，以便更全面的了解凋亡素基因?qū)δ懝馨┘?xì)胞的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)凋亡素基因能引發(fā)膽管癌細(xì)胞株QBC939的凋亡，凋亡率可達(dá)到61.9%，與Noteborn［8］在其他腫瘤的研究結(jié)果相似。但凋亡率較他們的結(jié)果相對(duì)偏低，可能有如下原因：(1)腫瘤細(xì)胞凋亡的異質(zhì)性。由于腫瘤細(xì)胞本身的遺傳背景使凋亡素引發(fā)不同腫瘤細(xì)胞的凋亡率是不會(huì)相同的。(2)雖然腺病毒的感染率很高，仍會(huì)有少量的細(xì)胞不被感染，而膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度很快，加之凋亡素最高效應(yīng)的發(fā)揮是在第5天左右，因此我們得到的結(jié)果偏低，但也明顯高于空病毒感染的膽管癌細(xì)胞和其自發(fā)的凋亡。本研究提示凋亡素能明顯抑制膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，在膽管癌的治療上具有較大的潛力。
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