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系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Fas和CD40L表達(dá)的初步研究
作者：徐紅星, 邱德華,王慧娟 ,楊曉帆,季曉輝
【摘要】 目的 探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者凋亡調(diào)節(jié)蛋白受體Fas及共刺激分子CD40L的表達(dá)情況及其相互之間的調(diào)節(jié)。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)SLE患者和正常人血清sFas和sCD40L的水平并分析兩者之間的相關(guān)性;同時(shí)分離10例SLE患者和10例正常對(duì)照的外周血淋巴細(xì)胞：①將細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞亞群表面Fas及CD40L的表達(dá)情況;②在培養(yǎng)過(guò)程中分別加入抗FasL抗體阻斷Fas信號(hào)及抗CD40L抗體阻斷CD40L信號(hào)后，觀察T細(xì)胞亞群表面CD40L及Fas的表達(dá)。結(jié)果 ①SLE患者血清sFas和sCD40L平均水平分別為4.18 μg/L和5.87 μg/L，顯著高于正常對(duì)照組2.27 μg/L和2.31 μg/L,且SLE患者血清sFas活動(dòng)期高于穩(wěn)定期(P<0.01或P<0.05);sFas、sCD40L水平與SLEDAI(疾病活動(dòng)指數(shù))之間存在一定的正相關(guān)性(r=0.688,r=0.253，P均<0.05),但sFas與sCD40L水平之間未顯示明顯相關(guān)(r=0.201，P>0.05)。②經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后，SLE患者CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞表面Fas表達(dá)增加，與正常對(duì)照組比較，差異有顯著性(P<0.01或P<0.05);SLE患者CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞表面CD40L表達(dá)增加，與正常對(duì)照組比較，差異有顯著性(P均<0.05)。③SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細(xì)胞上Fas與CD40L表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.311和r=0.517，P均<0.05)。④加入抗FasL抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞表面CD40L表達(dá)下降，與阻斷前比較，差異有顯著性(P<0.05);加入抗CD40L抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞表面Fas表達(dá)與阻斷前比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。結(jié)論 SLE患者血清sFas和sCD40L水平升高且呈正相關(guān)關(guān)系;T細(xì)胞亞群表面Fas及CD40L高表達(dá)且呈正相關(guān)關(guān)系;T細(xì)胞上Fas的表達(dá)調(diào)控CD40L的表達(dá)。說(shuō)明凋亡調(diào)節(jié)蛋白Fas及共刺激分子CD40L可能共同參與SLE的發(fā)病過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】 系統(tǒng)性紅斑狼瘡;Fas;CD40L
Abstract: Objective To investigate the expressions of Fas and CD40L in patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Methods Serum sFas, sCD40L levels in patients with SLE and healthy controls were determined using a commercially available ELISA system and the correlation between the levels of sFas and sCD40L was analyzed. Meanwhile, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients with SLE and health controls were isolated by gradient centrifugation of heparinized blood. The expressions of Fas and CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE and controls were determined by flow cytometry (FCM) after cultivation for 48 h. The antibodies of FasL and CD40L were add in the process of cultivation, and then the expressions of CD40L and Fas of peripheral blood T lymphocytes were determined. Results ①The average levels of sFas and sCD40L in SLE patients were 4.18 μg/L and 5.87 μg/L, respectively, which were markedly higher than those of 2.27 μg/L and 2.31 μg/L in the healthy controls; the serum levels of sFas and sCD40L were significantly higher in active SLE patients than those inactive patients (P<0.01, P<0.05); the serum levels of sFas and sCD40L were shown to have a positive correlation with SLEDAI scores (r=0.688, r=0.253,P<0.05), while no positive correlation was revealed between the levels of sFas and sCD40L (r=0.201,P>0.05). ②The expressions of Fas on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE were significantly higher than those of the healthy controls (P<0.01 and P<0.05); the expressions of CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE were significantly higher than that of the healthy controls (P<0.05). ③There was no correlations between the expressions of Fas on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes and those of CD40L (r=0.311, r=0.517). ④The expressions of CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE significantly decreased after blockage by the antibody of FasL (P<0.05); there was no difference in the expression of Fas in patients with SLE after blockage by the antibody of CD40L (P>0.05). Conclusion The levels of sFas and sCD40L in SLE patients were higher than those of healthy controls and there was a positive correlation between them. The expressions of Fas and CD40L on CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes in patients with SLE increased; and the expression of Fas had a positive correlation with that of CD40L; meanwhile, the expression of Fas regulated that of CD40L, which suggests that both Fas and CD40L are involed in the process of SLE.
Key words：systemic lupus erythematosus; Fas; CD40L
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種慢性自身免疫性疾病，引起多器官損害，具有產(chǎn)生多種自身抗體的特點(diǎn)[1]。Fas和CD40L均屬于TNF/NGF受體超家族成員。Fas是一種細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)蛋白受體，通過(guò)與Fas配體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。CD40L是表達(dá)于B細(xì)胞或其他抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面的CD40分子的配體，目前認(rèn)為，共刺激分子CD40-CD40L是為激活淋巴細(xì)胞的第二信號(hào)系統(tǒng)的組成部分，其在T細(xì)胞介導(dǎo)的B細(xì)胞活化中具有重要作用[3-4]。本研究同時(shí)檢測(cè)SLE患者血清sFas和sCD40L水平及外周血CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞表面CD40L和Fas的表達(dá)，并用抗FasL抗體、抗CD40L抗體分別阻斷Fas信號(hào)和CD40信號(hào)測(cè)定CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞表面CD40L和Fas的表達(dá)，觀察了淋巴細(xì)胞表面Fas與CD40L表達(dá)的相關(guān)性及相互之間是否存在表達(dá)的調(diào)控情況，從而探討Fas和CD40L參與SLE發(fā)病過(guò)程的可能尚未被認(rèn)識(shí)的機(jī)制。
1 資料和方法
1.1 研究對(duì)象和分組 ①SLE組：南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院門診或住院的SLE患者46例，其中女性42例，男性4例，年齡9～61歲，平均年齡32歲。其中36例進(jìn)行血清sFas、sCD40L測(cè)定,10例進(jìn)行T細(xì)胞亞群表面Fas與CD40L表達(dá)及相關(guān)性研究。所有SLE病例均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ARA)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，參照SLE疾病活動(dòng)性指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)[5]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，判斷SLE的病情活動(dòng)性，將SLE組患者進(jìn)一步分為活動(dòng)期(SLEDAI≥ 10)及緩解期(SLEDAI<10)2個(gè)亞組。②正常對(duì)照組:30例，其中男3例，女27例，平均年齡32.5歲，均為門診健康體檢者。
1.2 主要儀器 MicroReader4型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,HFsafe-900型生物安全柜;TC2323型二氧化碳培養(yǎng)箱,Coulter公司流式細(xì)胞儀。
1.3 主要試劑 晶美生物工程有限公司sFas檢測(cè)試劑盒,Bender MedSystems公司sCD40L檢測(cè)試劑盒,上海試劑二廠淋巴細(xì)胞分離液,GIBCO公司RPMI 1640培養(yǎng)液,eBioscience公司抗人FasL、抗人CD40L阻斷性抗體,Caltag公司PE-CY5-抗CD3、FITC-抗CD4、FITC-抗CD8熒光標(biāo)記抗體,eBioscience公司PE-抗CD40L、PE-抗Fas熒光標(biāo)記抗體。
1.3 方法
1.3.1 sFas、sCD40L的檢測(cè) 嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行操作。結(jié)果判斷：用MicroReader4酶標(biāo)儀比色，得到光密度(D)值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，D值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)，通過(guò)標(biāo)本的D值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。
1.3.2 細(xì)胞分離培養(yǎng) 取正常健康體檢者和SLE患者肝素抗凝外周靜脈血，用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度至1×109/L，加入24孔培養(yǎng)板中37℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。SLE患者細(xì)胞培養(yǎng)液中純化抗人FasL抗體和純化抗人CD40L抗體濃度均為1 mg/L。正常對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中植物血凝素(PHA)濃度為75 mg/L。
1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取100 μl細(xì)胞懸液，分別加入抗CD3、抗CD4、抗CD8單抗各5 μl，加入抗Fas抗體或抗CD40L抗體20 μl，在對(duì)照管中加入正常小鼠IgG1(κ獨(dú)特型)20 μl，混勻后置室溫20 min，用PBS洗1次，棄上清液加入生理鹽水0.5 ml后進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用±s表示，樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)資料進(jìn)行分析，P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。
2 結(jié) 果
2.1 SLE患者與正常對(duì)照組血清sFas、sCD40L檢測(cè)結(jié)果比較 SLE患者血清sFas、sCD40L水平均明顯高于正常對(duì)照組(P均<0.01)，SLE患者血清sFas、sCD40L水平活動(dòng)期均高于緩解期(P<0.01或P<0.05)。見表1。
2.2 SLE患者血清sFas、sCD40L水平與SLEDAI積分的相關(guān)性分析及sFas、sCD40L水平之間的相關(guān)性分析 sFas、sCD40L與SLEDAI積分之間均存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.688、r=0.253，P均<0.05)，sFas與sCD40L水平之間未顯示明顯相關(guān)(r=0.201，P>0.05)。表1 SLE患者和正常對(duì)照組血清sFas、sCD40L水平與正常對(duì)照組比較：*P<0.05;**P<0.01
2.3 SLE患者和正常對(duì)照組CD4(+)及CD8(+) T細(xì)胞表面Fas和CD40L表達(dá)的比較 SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細(xì)胞表面表達(dá)的Fas顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01或P<0.05);SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細(xì)胞表面表達(dá)的CD40L也高于正常對(duì)照組(P均<0.05)。見表2。表2 SLE患者和正常對(duì)照組間T細(xì)胞表面Fas、CD40L表達(dá)的比較與正常對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01
2.4 SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細(xì)胞Fas與CD40L表達(dá)的相關(guān)性比較 SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細(xì)胞上Fas與CD40L表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.311、r=0.517,P均<0.05)。
2.5 SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細(xì)胞在抗人FasL抗體及抗人CD40L抗體阻斷前后CD40L及Fas表達(dá)的比較 SLE患者T細(xì)胞培養(yǎng)中加入抗FasL抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞表面CD40L表達(dá)與阻斷前比較均明顯下降(P<0.05);加入抗CD40L抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞表面Fas表達(dá)與阻斷前比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見表3。表3 SLE患者CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞在抗人CD40L抗體阻斷前后CD40L、FAS 表達(dá)的比較與阻斷前比較：*P<0.05
3 討 論
SLE是一種至今病因未明的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。近來(lái)研究較多的是與自身免疫性疾病關(guān)系密切的T細(xì)胞表面分子Fas和CD40L，兩者在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著極其重要的免疫調(diào)節(jié)作用。Fas是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的細(xì)胞表面分子，其配體是FasL，F(xiàn)as/FasL參與細(xì)胞凋亡過(guò)程;CD40L是CD40的配體，屬TNF超家族成員，主要存在于活化的CD4(+) T細(xì)胞表面，亦少量表達(dá)于CD8(+) T細(xì)胞﹑B細(xì)胞﹑NK細(xì)胞﹑單核細(xì)胞及血小板表面。表達(dá)于B細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞表面的CD40分子與其配體CD40L間的相互作用構(gòu)成了一組重要的共刺激信號(hào)[6-7]。
研究表明，靜止的T細(xì)胞表達(dá)一定量的Fas，但對(duì)凋亡不敏感，當(dāng)抗原與T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合后，在靜止T細(xì)胞被激活而增殖的同時(shí)，也啟動(dòng)凋亡，導(dǎo)致涉及凋亡的Fas基因轉(zhuǎn)錄增加，F(xiàn)as表達(dá)上調(diào)，SLE患者T細(xì)胞表面表達(dá)的Fas增加[8]。同時(shí)有研究表明，SLE患者外周血T、B細(xì)胞表面CD40L表達(dá)增加，且活化T細(xì)胞表達(dá)CD40L[9]。說(shuō)明SLE的發(fā)生、發(fā)展與凋亡調(diào)節(jié)分子和共刺激分子的異常密切相關(guān)。
我們的研究結(jié)果顯示，不僅SLE患者血清sFas與sCD40L水平升高且呈正相關(guān)關(guān)系，而且，SLE患者CD4(+) T細(xì)胞和CD8(+) T細(xì)胞表面的Fas表達(dá)高于正常對(duì)照組，反映了SLE患者T細(xì)胞處于異常活化狀態(tài);Fas表達(dá)增加，參與誘導(dǎo)了SLE患者T細(xì)胞凋亡;SLE患者CD4(+) T細(xì)胞和CD8(+) T細(xì)胞表面CD40L的表達(dá)也升高，也反映了SLE患者T細(xì)胞的活化。已有研究證實(shí)，部分活化的T細(xì)胞在無(wú)輔助刺激信號(hào)條件下即可分泌細(xì)胞因子如IL-1α、IL-1β、IL-12等，這些細(xì)胞因子可作為第二信號(hào)作用于T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞的進(jìn)一步活化、分化和增殖，表達(dá)較強(qiáng)的CD40L[10]。進(jìn)一步分析表明，SLE患者CD4(+)及CD8(+) T細(xì)胞上Fas與CD40L表達(dá)也呈正相關(guān)關(guān)系，提示Fas表達(dá)與CD40L表達(dá)的密切相關(guān)性。同時(shí)，加入抗FasL抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞表面CD40L表達(dá)下降，與阻斷前比較，差異有顯著性(P<0.05);加入抗CD40L抗體阻斷后，CD4(+)和CD8(+) T細(xì)胞表面Fas表達(dá)與阻斷前比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。這一結(jié)果說(shuō)明，T細(xì)胞上Fas的信號(hào)可能對(duì)CD40L的表達(dá)有調(diào)控作用，但CD40/CD40L信號(hào)則未呈現(xiàn)對(duì)Fas表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
T細(xì)胞上調(diào)CD40L表達(dá)有重要的生物學(xué)意義。在SLE的病理機(jī)制中，T細(xì)胞CD40L表達(dá)的上調(diào)，可進(jìn)一步導(dǎo)致自身反應(yīng)性B細(xì)胞的活化、增殖、分化和自身抗體的產(chǎn)生。而且，盡管SLE的T細(xì)胞高表達(dá)Fas，T細(xì)胞凋亡明顯，而B細(xì)胞卻凋亡并不顯著[11]，這可能與CD40L介導(dǎo)的信號(hào)可使活化的B細(xì)胞降低對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性、使B細(xì)胞逃逸凋亡有關(guān)，也促進(jìn)了自身抗體的產(chǎn)生[12]。因此，F(xiàn)as/FasL相互作用形成的Fas信號(hào)上調(diào)T細(xì)胞CD40L表達(dá)，可能是這兩個(gè)細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)共同參與SLE發(fā)病的機(jī)制之一。
最近，Collins等[13]發(fā)現(xiàn)，從萊姆病關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液中分離獲得的Vdelta1 T細(xì)胞高表達(dá)FasL，可通過(guò)Fas/FasL信號(hào)途徑作用于不成熟樹突細(xì)胞(DC)表面的Fas，促進(jìn)DC的活化和成熟，B細(xì)胞在自身抗體持續(xù)產(chǎn)生中是否也起類似DC的作用值得深入研究。
迄今為止，尚未見到關(guān)于Fas/FasL可上調(diào)T細(xì)胞CD40L表達(dá)的研究報(bào)告。本研究的實(shí)驗(yàn)則初步提示了這種相互調(diào)節(jié)的可能。當(dāng)然，這還需要進(jìn)一步的深入研究加以證實(shí)。
目前SLE的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，F(xiàn)as、CD40L的高表達(dá)可能是SLE發(fā)病的重要原因，研究Fas及CD40L信號(hào)的相互調(diào)節(jié)可能會(huì)為探討SLE發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)提供新的線索。
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