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擬Smac作用下膀胱癌T24 細(xì)胞增殖及凋亡的研究
引言
Smac/DIABLO 蛋白（線粒體促凋亡蛋白）自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，經(jīng)過(guò)幾年的研究已經(jīng)成為細(xì)胞凋亡研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者將其應(yīng)用于泌尿系統(tǒng)腫瘤研究和治療，并認(rèn)為Smac/DIABLO及由它衍生而來(lái)的小分子多肽及其類(lèi)似物將為未來(lái)泌尿系統(tǒng)腫瘤的治療開(kāi)辟一個(gè)新領(lǐng)域[1]。納米技術(shù)作為近年來(lái)出現(xiàn)的高技術(shù)新興科學(xué)，由于其表現(xiàn)出現(xiàn)的各種特性，有利于醫(yī)學(xué)及其各個(gè)分支的研究，特別是對(duì)腫瘤的早期診斷和治療有著顯著的意義。
本文將二者相互聯(lián)系，通過(guò)合成的擬Smac 多肽磁性納米粒作用于膀胱癌T24 細(xì)胞，探討其對(duì)膀胱癌T24 細(xì)胞的增殖及凋亡的影響2. 材料與方法2.1 試劑擬 Smac 合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物（SmacN7-O-CMC-MNPS）由前期實(shí)驗(yàn)制備合成。MTT 溶液、Hoechst33258 染色試劑盒購(gòu)自武漢凌飛生物公司。抗Bcl-2、Bax、β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)cellsignal 公司。RPMI1640 培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司。
其他常用生化試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。
2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)
設(shè)正常對(duì)照組（A）、單純SmacN7-O-CMC-MNPS 組（B）和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁場(chǎng)組（C）。膀胱癌T24 細(xì)胞用含10%的胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)用無(wú)血清1640 洗滌2 次，每孔滴加0.5μmol/L 的SmacN7-O-CMC-MNPS，C 組磁場(chǎng)為8mT。轉(zhuǎn)染4h 后加入含胎牛血清的1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
2.3 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖參照 MTT 試劑盒使用說(shuō)明。
以細(xì)胞密度約104/孔接種于96 孔板，按照上述實(shí)驗(yàn)分組，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，每孔100ul，按照不同分組加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h 后采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，繪制細(xì)胞增殖率變化曲線，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A490nm/正常對(duì)照組A490nm×100%，（A 為吸光度值）細(xì)胞增殖抑制率=（1-細(xì)胞增殖率）×100%。
2.4 Hoechst33258 檢測(cè)細(xì)胞凋亡將各實(shí)驗(yàn)組
按照上述實(shí)驗(yàn)方法處理24h 后，用0.25%胰酶+0.02%的EDTA 消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度約為107 /ml,取細(xì)胞懸液100ul，加5ul Hoechst33258 染液（100ug/ml）細(xì)胞懸液中，充分混勻后滴于載玻片上，蓋片封片后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝影。
2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Realtime RT-PCR）檢測(cè)
P53,Bax,Bcl-2 mRNA 的表達(dá)采用 TRIZOL 試劑兩步法提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總RNA，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)綠試劑盒合成cDNA.使用primer5.0 設(shè)計(jì)Bax、Bcl-2、β-actin 引物。反應(yīng)體系20ul：cDNA 0.8ul、上游引物0.8 ul、下游引物0.8ul、SYBR Green Mix 10ul、DEPC H2O 7.6ul.擴(kuò)增條件：94℃ 預(yù)變性5min，94℃ 30S， x℃(不同基因退火溫度不同)15S, 72℃15S,共計(jì)40 個(gè)循環(huán)，72°延伸10min，每0.2℃讀板一次，繪制擴(kuò)增曲線及溶解曲線，收集數(shù)據(jù)。
2.6 蛋白免疫印跡（Western-Blot）檢測(cè)
Bax,Bcl-2 蛋白的表達(dá)收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，用BCA 試劑盒對(duì)蛋白樣品定量。取等量蛋白20ug 上樣于10%的SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠），以120mV 恒壓電泳1h，200mA 恒流轉(zhuǎn)膜50min，膜于含5%脫脂奶粉的TBST20ml 封閉液室溫封閉30min，加一抗(1:1000)4℃過(guò)夜，次日TBST 洗膜10min×3 次，加用封閉液稀釋的HRP 標(biāo)記的二抗（1：7500）室溫1h，TBST 洗膜10min×3次，加ECL 發(fā)光，X 膠片曝光，洗片，收集數(shù)據(jù)。
2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)
均以x ± s表示，采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，不同處理組間差異采用ANOVA或 Dunnett T-test，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3. 結(jié)果3.1 SmacN7-O-CMC-MNPS 聯(lián)合磁場(chǎng)
能顯著抑制膀胱癌T24 細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡和對(duì)照組相比，SmacN7-O-CMC-MNPS轉(zhuǎn)染膀胱癌T24 細(xì)胞后和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁場(chǎng)組均不同程度地出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡；而SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒外加磁場(chǎng)對(duì)T24 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用更明顯。
3.2 SmacN7-O-CMC-MNPS
聯(lián)合磁場(chǎng)對(duì)膀胱癌T24 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達(dá)的影響在外磁場(chǎng)條件下，SmacN7-O-CMC-MNPS 轉(zhuǎn)染膀胱癌T24 細(xì)胞24h、48h、72h 后采用Realtime RT-PCR 及Western blot 檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)Bcl-2 的mRNA 和蛋白的表達(dá)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。相反，Bax 的表達(dá)量則逐漸升高，且此效應(yīng)比不加磁場(chǎng)的SmacN7-O-CMC-MNPS 轉(zhuǎn)染膀胱癌T24 細(xì)胞的作用更明顯，這說(shuō)明外磁場(chǎng)條件下SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒能透過(guò)膀胱癌T24 細(xì)胞細(xì)胞膜，通過(guò)干擾凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
4. 討論Smac/DIABLO 在胞漿中合成最初的前體蛋白
含239 個(gè)氨基酸，分子量為27KD，SmacmRNA 全長(zhǎng)1.5Kb。全長(zhǎng)的Smac/DIABLO 蛋白沒(méi)有任何活性，必須在線粒體內(nèi)進(jìn)行信號(hào)肽的切除后才能獲得促凋亡生物活性。Smac/DIABLO 參與細(xì)胞凋亡的死亡受體通路和線粒體通路的下游反應(yīng)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合凋亡抑制蛋白IAPs 解除對(duì)caspase 的阻遏而促進(jìn)凋亡的發(fā)生。Smac/DIABLO 蛋白衍生的含AVPI 四肽結(jié)構(gòu)的小分子多肽也具有重要的抗腫瘤效果。研究表明，Smac/DIABLO 小肽與載體蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以使體內(nèi)和體外化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡效果明顯增加。Smac/DIABLO 蛋白通過(guò)干擾凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其過(guò)度增殖。
多肽合成技術(shù)的突破性進(jìn)步，使多肽類(lèi)藥物顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)藥物的治療效果，但由于其具有難以透過(guò)生物膜屏障且不穩(wěn)定、易降解變性等特點(diǎn)限制了它的臨床應(yīng)用。如果將靶向藥物進(jìn)行適當(dāng)修飾就可能起到保護(hù)藥物，提高藥物的穩(wěn)定性，促進(jìn)藥物的吸收利用，進(jìn)而產(chǎn)生良好的生物學(xué)效果。磁性納米顆�？梢宰鳛槎嚯�、激素、單克隆抗體、基因等物質(zhì)的載體，也可以攜帶藥物；同時(shí)它具有超順磁特性，即在磁場(chǎng)中有較強(qiáng)的磁性，沒(méi)有磁場(chǎng)時(shí)磁性很快會(huì)消失，從而不會(huì)被永久磁化；而且納米級(jí)Fe3O4 能夠排出體外，在外加磁場(chǎng)的作用下可以使得其作為載體復(fù)合物所攜帶的藥物作定向移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)靶向治療。
Smac 是一種新型的線粒體促凋亡蛋白，其N(xiāo) 端的AVPI 四肽發(fā)揮著重要的促凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)合成擬Smac 多肽羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物，在外加磁場(chǎng)下作用于膀胱癌T24 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，外加磁場(chǎng)的誘導(dǎo)下SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒能發(fā)揮擬Smac 合成肽的抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促凋亡作用，且外加磁場(chǎng)作用更為明顯。而且，SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒是通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bcl-2，Bax 來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的活性。
綜上，本實(shí)驗(yàn)首次將人工合成促凋亡多肽制成磁性納米顆粒SmacN7-O-CMC-MNPS 在外加磁場(chǎng)下作用于膀胱癌細(xì)胞，顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為膀胱腫瘤的體內(nèi)磁導(dǎo)向靶向治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)保障。
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