研究凋亡素參與正常細(xì)胞核蛋白表達(dá)差異

　　1．引言

　　凋亡素能夠特異引起腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋亡，這種細(xì)胞凋亡是非P53 依賴的，而不能夠?qū)е抡�常�?xì)胞的凋亡，這與凋亡素的核定位有關(guān)。凋亡素是一種在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間穿梭的蛋白。無論是在腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞內(nèi)，凋亡素都能夠通過核定位信號進(jìn)入細(xì)胞核。然而在腫瘤細(xì)胞中，凋亡素被修飾，導(dǎo)致出核信號的失活，定位在細(xì)胞核內(nèi)，引起腫瘤細(xì)胞的凋亡；而在正常細(xì)胞中，凋亡素又通過出核信號出核，定位在細(xì)胞漿內(nèi)，不引起正常細(xì)胞的凋亡。

　　綜上所述，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的蛋白表達(dá)一定存在著某種差異，使得凋亡素在腫瘤細(xì)胞中被特異地修飾。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來尋找腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞核內(nèi)的蛋白表達(dá)差異，以期望能夠進(jìn)一步探討凋亡素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞特異凋亡的機(jī)制。

　　2．材料和方法

　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料PureyieldTM Plasmid Midiprep System(Promega)、RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、新生牛血清（GIBCO）、轉(zhuǎn)染試劑LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen)、蛋白酶抑制劑（sigma）、pEGFP-C1、pEGFP-C1-apoptin 由倫敦大學(xué)醫(yī)學(xué)院Tavassoli 博士惠贈，JM109 菌株由本室保存，HepG2 細(xì)胞、L02 細(xì)胞由本校遺傳教研室饋贈。

　　2.2 pEGFP-C1-apoptin 載體的提取按照 Promega 公司PureyieldTM Plasmid Midiprep System 提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的提取。

　　2.3 細(xì)胞培養(yǎng)用含 RPMI1640、10%新生牛血清的培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2 及飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞、L02 細(xì)胞，每2d 傳代一次。

　　2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)行 24 孔板貼壁細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染，將pEGFP-C1-apoptin 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG2 和L02兩種細(xì)胞。

　　2.5 激光共聚焦檢測apoptin 定位轉(zhuǎn)染后24、 48h 將 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板取出,在各組細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入 Hoechst 33342染液(終濃度為 10μ g/ml), 37℃恒溫避光染色 15min, PBS 洗3 次,去除未結(jié)合的 Hoechst33342, 激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察,拍照。

　　2.6 細(xì)胞核蛋白提取用含 RPMI1640、10%新生牛血清的培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2 及飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染24h、48h 后的HepG2 細(xì)胞、L02 細(xì)胞。收集上述細(xì)胞，常規(guī)消化，用PBS(ph7 .2)洗1 次，4℃ 1080rpm 離心5min。棄上清，細(xì)胞壓積加緩沖液A 400μl，蛋白酶抑制劑2μl，混懸，冰上腫脹15 min，再加10％ NP-40 50μl，渦動10 s。10000 g，離心20 s (室溫)。仔細(xì)棄全部上清，加蛋白酶抑制劑2μl，緩沖液B 400μl，混懸，冰浴1h，間以攪拌。超聲去核酸，工作時間2s，間歇時間10s，功率200w。4℃，14 000 g，1h，吸取上清，分裝。用Bradford 法測蛋白濃度。

　　2.7 細(xì)胞核蛋白的雙向電泳將提好的細(xì)胞核蛋白樣品分裝，送公司進(jìn)行雙向電泳。

　　3．實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

　　3.1 激光共聚焦檢測凋亡素定位結(jié)果激光共聚焦熒光顯微鏡觀察凋亡素轉(zhuǎn)染24 及48 小時后，在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的定位情況。轉(zhuǎn)染24 小時后，凋亡素定位在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞核，無明顯的凋亡形態(tài)特征變化。轉(zhuǎn)染48 小時后，凋亡素從正常細(xì)胞核內(nèi)出來在胞質(zhì)中聚集，無凋亡形態(tài)特征變化；而仍定位于腫瘤細(xì)胞的核內(nèi)，聚集，可以見到細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚，細(xì)胞核裂解為碎塊，邊緣不清晰，產(chǎn)生凋亡小體，引起腫瘤細(xì)胞的特異凋亡。

　　3.2 雙向電泳結(jié)果我們通過雙向電泳進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)HepG2 與L02 細(xì)胞核蛋白表達(dá)存在差異。

　　4．討論

　　凋亡素能夠特異引起腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋亡，這種細(xì)胞凋亡是非P53 依賴的，而不能夠?qū)е抡�常�?xì)胞的凋亡。同時我們觀察到，凋亡素在細(xì)胞內(nèi)的定位與其凋亡功能密切相關(guān)。將凋亡素的基因轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，24 小時后，我們發(fā)現(xiàn)凋亡素?zé)o論在腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞，都定位在細(xì)胞核內(nèi)，都不引起細(xì)胞的凋亡。48 小時后，凋亡素在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)聚集，行使凋亡功能，而凋亡素卻從正常細(xì)胞的核內(nèi)出來，在胞質(zhì)內(nèi)聚集，不能引起正常細(xì)胞的凋亡。于是我們推測，凋亡素行使凋亡功能與其在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)受到某種修飾，而停留在細(xì)胞核內(nèi)有關(guān)。而這種修飾在正常細(xì)胞的核內(nèi)是沒有的，因此腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間一定存在著某種蛋白表達(dá)的差異。

　　凋亡素包含兩個分開的核定位信號（位置82-88，111-121），和一個CRM1 調(diào)節(jié)的核輸出信號。有文獻(xiàn)報道，當(dāng)?shù)蛲鏊剡M(jìn)入腫瘤細(xì)胞核內(nèi)后，其108 位的蘇氨酸被磷酸化，抑制了CRM1 的活性，影響了凋亡素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的核輸出。而凋亡素在正常細(xì)胞內(nèi)不被磷酸化，核輸出信號依賴CRM1 使凋亡素從核內(nèi)輸出，在胞質(zhì)內(nèi)聚集成大的聚合體，而最終被其他蛋白所中和，喪失了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能。

　　因此，我們可以推測在腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在著特異的磷酸激酶，或者其他某種能使凋亡素特異修飾的蛋白。

　　目前高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法已經(jīng)成為了有力的手段，蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定技術(shù)和生物信息學(xué)迅猛發(fā)展。高分辨率、高敏感性和高流通性的分離和分離后鑒定技術(shù)，結(jié)合準(zhǔn)確、全面的數(shù)據(jù)庫技術(shù)，使蛋白質(zhì)組技術(shù)用于生物研究卓有成效。我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法找到了腫瘤細(xì)胞HepG2 細(xì)胞和正常細(xì)胞L02 細(xì)胞核蛋白表達(dá)的差異，但是由于時間關(guān)系，沒有對差異點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定，這是我們下一步的工作，以期望能夠找到這個特異的蛋白，來完善凋亡素的機(jī)制研究。

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