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淺談化學發(fā)光免疫分析的研究進展論文

時間:2024-07-12 00:08:02 化學畢業(yè)論文 我要投稿
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淺談化學發(fā)光免疫分析的研究進展論文

  建立在放射免疫分析技術理論基礎上的化學發(fā)光免疫分析,是一種非放射標記免疫分析法,這種免疫分析方法主要以標記發(fā)光劑為示蹤物信號建立起來。近十年來在世界范圍內發(fā)展迅速,它具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快速、標記物穩(wěn)定性好、無污染、儀器簡單經濟等優(yōu)點。

淺談化學發(fā)光免疫分析的研究進展論文

  1 化學發(fā)光免疫分析技術的研究歷史背景

  免疫分析的發(fā)展伴隨著抗體制備技術的改進而不斷提高。美國科學家Yalow等人首先將標記技術引入免疫分析,他們首先用放射免疫分析法(RIA)進行測定胰島素。由于這種試驗方法限制了試劑的壽命,難以獲得長期穩(wěn)定的檢測標準,同時由于存在同位素的使用,不僅會損害操作人員身體健康,也會帶來污物處理困難的問題。為了找到更為合理的免疫分析法成為以后20年來研究的熱點。直到70年代末,國外有學者將免疫反應與化學發(fā)光測定技術相結合,這種集高靈敏度和高特異性的技術稱之為化學發(fā)光免疫分析法,化學發(fā)光免疫技術優(yōu)勢比較明顯,主要有以下幾點:第一,靈敏度高,檢測限范圍更精準;第二,自動化程度高,并且沒有放射性輻射危害;第三,發(fā)光標記物穩(wěn)定,有效期長,同時應用范圍寬,對于分子大小不同的抗原、半抗原及抗體都可檢測。因此,化學發(fā)光免疫分析在臨床、衛(wèi)生、食品、環(huán)保和軍事等領域正被越來越多地用于激素、蛋白質、腫瘤、毒物、病毒等成分檢測。

  2 免疫分析基本原理

  由免疫反應系統(tǒng)和化學發(fā)光分析系統(tǒng)兩個關鍵部分組成了化學發(fā)光免疫分析的基本原理,化學發(fā)光分析系統(tǒng)主要氧化以及催化的作用于化學發(fā)光物質,產生一個激發(fā)態(tài)的中間體,在處于穩(wěn)定狀態(tài)時,發(fā)射出光子,然后通過測量儀器測量光量子。通過標記物與發(fā)光強度的關系,進而測出被測物質含量。而免疫反應系統(tǒng)是將發(fā)光物質在抗原或抗體上直接標記。

  3 化學免疫分析分類

  化學發(fā)光免疫分析法主要以標記法的不同來進行分類,目前習慣上將免疫分析法主要分為兩類,第一主要是標記免疫分析法,其次是酶免疫分析法,前者是以化學發(fā)光標記,后者是以酶標記,以化學發(fā)光底物作為信號試劑來進行發(fā)光,其原理是不相同的。除此之外,包括熒光免疫分析法以及電化學發(fā)光免疫分析法也是目前存在的化學免疫法分析方法。

  3.1 化學發(fā)光標記免疫分析

  將化學發(fā)光劑如吖啶酯類化合物,直接標記在抗原上或抗體上,其基本原理是啟動發(fā)光劑發(fā)光,快速閃爍。這種標記物其化學反應簡單、快速、無須催化劑;夾心法用于大分子抗原,競爭法主要用于檢測小分子抗原,另外本底低,非特異性結合相對較少光量不會因為分子大小而受影響,因此能增加靈敏度,一般常用的化學發(fā)光物質主要是通過啟動發(fā)光試劑NaOH-H2O2作用而發(fā)光,其發(fā)光非常迅速,小分子物質多采用競爭法,夾心法主要用于大分子物質。

  3.2 化學發(fā)光酶免疫分析

  通過酶標記生物活性物質,再作用于發(fā)光底物,在信號劑的作用下發(fā)光,然后用發(fā)光測定儀進行測定。化學發(fā)光酶免疫分析酶反應的底物是發(fā)光劑,按照標記免疫分析,應屬酶免疫分析,其操作步驟與酶免分析完全相同。目前常用的標記酶為堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶,它們有各自的發(fā)光底物;瘜W發(fā)光酶免疫分析法種類大致有三種,首先是HRP標記CLEIA,一般常用3-氨基鄰苯二甲酰肼作為底物,也即是魯米諾或者用其衍生物4-氨基鄰苯二甲酰肼也是可以的,這兩種都是重要的發(fā)光試劑。需要注意的是該底物需要在堿性緩沖溶液中進行氧化反應,生成激發(fā)態(tài)中間體,當然這需要在過氧化物酶及活性氧存在的條件下進行,中間體回到基態(tài)時就可以發(fā)光,此時的波長一般在425nm。曾經先前有人用該標記底物標記抗原或抗體,但后來發(fā)現(xiàn)其發(fā)光強度多受靈敏度的影響。目前用過氧化物酶進行標記,其發(fā)光強度主要依賴酶免疫反應中的酶的濃度大小;其次增強發(fā)光酶免疫分析也是化學發(fā)光酶免疫分析的一種,它主要是在將增強的發(fā)光劑加入到發(fā)光系統(tǒng)中,加強發(fā)光的信號強度,并且能夠保持長時間的穩(wěn)定性,在一定程度上提高了該分析方法的準確性和靈敏度,便于多次測定。目前在一些現(xiàn)代化的設備上,還可以由計算機進行精確控制操作,比如,往系統(tǒng)中加入發(fā)光試劑以及混合、溫育、洗滌等,甚至后期的數(shù)據(jù)處理,進而繪制標準曲線,最終完成患者血清樣品的分析并打印出結果;最后一種就是用ALP標記的CLEIA,這種分析方法一般多用環(huán)-1,22-二氧乙烷衍生物作為發(fā)光底物,它的發(fā)光原理主要是其用化學發(fā)光酶免疫分析底物而設計的分子結構穩(wěn)固,其中的芳香基作為發(fā)光基團和酶作用,在發(fā)光試劑的作用下發(fā)光,該底物在堿性磷酸酶的作用下,磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個磷酸基,就會產生一個穩(wěn)定的中間體,然后中間體發(fā)生裂解會產生金剛烷酮和激發(fā)態(tài)的物質,這種常見底物是AMPPD,其作為磷酸酯酶的直接化學發(fā)光底物,多用來檢測堿性磷酸酯酶和一些配基的結合物。

  4 應用

  4.1 激素、蛋白質和腫瘤檢測

  該系統(tǒng)使反應物形成均相混懸液,順磁微粒作為固定相,增大反應面積,加速免疫反應,快速分離,自動洗滌,減少酶和催化劑的使用,pH調整即可,避免了許多影響因素,廣泛應用于甲狀腺功能、藥物檢測、腫瘤標志物及心血管等項目。

  4.2 病毒、毒物檢測

  楊秀岑等用ABEI標記兔抗大腸桿菌lgG,試樣溫育、離心、沉淀峰值用luminol-H2O2-NaOH 發(fā)光體系測定;章竹君等測定了糞樣中的輪狀病毒以HRP酶標記;為研究TNT對人體的毒害作用提供方法,張麗民等以HRP標記免疫測定了血清中4-氨基-2,6-二硝基甲苯,效果非常顯著。

  4.3 其他方面的應用

  被越來越多地用于免疫測定中的HRP酶標記生成核酸探針,主要采用兩種形式,一種是靶DNA雜交,將HRP直接標記在探針上,同時增強的魯米諾試劑檢測加入分離后的雜交體。另外一種是將DNA探針標記在生物素及地高辛上,然后與靶DNA雜交,再用HRP標記的親和素和抗地高辛與分離后的雜交體結合,最后加入魯米諾試劑氧化發(fā)光。

  5 展望

  化學發(fā)光免疫分析已成為生物技術領域的一種重要的檢測方法,其相比較于傳統(tǒng)的放射免疫分析方法,其安全、穩(wěn)定、測量快速等優(yōu)點被廣泛應用。當然,目前化學發(fā)光免疫分析技術也存在不少的問題,例如,化學發(fā)光標記物質量和穩(wěn)定性差,包括標記技術都是比較落后的。因此,要想獲得更為廣泛的發(fā)展和使用空間,首先要加快國產發(fā)光免疫分析試劑盒的研發(fā),另外要提高分析和測定的穩(wěn)定性,只有這樣,將來化學發(fā)光免疫分析技術用于臨床醫(yī)學檢驗,才能帶來更大的獲益。

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