組合生物合成應(yīng)用于藥物開發(fā)的研究
隨著分子合成生物技術(shù)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了在特征宿主微生物中異源表達(dá)來自于不同屬的基因，以下是小編搜集的一篇探究組合生物合成應(yīng)用于藥物開發(fā)的論文范文，供大家閱讀查看。
引言
近20年來，開發(fā)的新藥當(dāng)中有64%的小分子藥物來源于天然產(chǎn)物或天然產(chǎn)物的衍生物。這些天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣，具有獨(dú)特的生物活性，是微生物的次級代謝產(chǎn)物。天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，導(dǎo)致獲取有藥物活性的類似物難度變大。組合生物合成利用底物寬泛性和酶工程制備新的非天然產(chǎn)物，使具有潛在活性的天然產(chǎn)物種類多樣化。組合生物合成應(yīng)用于藥物開發(fā)，有3個優(yōu)點(diǎn)：(1)組合生物合成有助于提高天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)框架新穎性和多樣性，增加了天然產(chǎn)物的生物特征;(2)組合生物學(xué)是一種制備天然產(chǎn)物類似物的環(huán)境友好型方式;(3)在基因改良的異源宿主細(xì)胞中高效表達(dá)組合生物合成途徑能夠增加化合物產(chǎn)量，降低藥物成本。組合生物合成方法有如下3種：(1)前體-定向生物合成;(2)酶-水平修飾，整個結(jié)構(gòu)域、模塊和亞基的置換，定點(diǎn)突變，定向進(jìn)化;(3)途徑-水平的重組。
1、前體-定向組合生物合成
天然產(chǎn)物組裝鏈中構(gòu)建模塊的多樣性決定了天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性。前體-定向組合生物合成利用酶的底物寬泛性，在合成途徑中摻入非天然結(jié)構(gòu)單元，產(chǎn)生多種天然產(chǎn)物類似物。
模塊化I型聚酮合酶(mPKSs)是含有序列化模塊的聚酮合酶(PKS)組裝鏈，它的每個模塊都有一系列催化鏈?zhǔn)窖h(huán)反應(yīng)的催化域。聚醚類抗菌素Monensin是Streptomycescinnamonensis的mPKS生物合成產(chǎn)物。MonensinPKS的第5個模塊中乙酰轉(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域能夠以非天然的丙二酸衍生物為結(jié)構(gòu)單元合成新的Monensin前體類似物。Bravo-Rodriguez等以AT域的計(jì)算模式為基礎(chǔ)，預(yù)測AT結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)能夠接受具有多個炔丙基基團(tuán)的結(jié)構(gòu)單元。在添加有炔丙基-丙二酰-N-乙酰-巰乙胺的培養(yǎng)基中，S.CinnamonensisA495能產(chǎn)生炔丙基-premonensin.該化合物可以結(jié)合到人的磷酸二酯酶δ亞基(PDEδ)，能夠潛在地抑制PDEδ-KRAS相互作用，從而抑制KRAS-依賴型人胰腺癌細(xì)胞的生長。
與mPKSs相似，非核糖體肽合成酶可以組裝多種藥用肽，包括抗生素(放線菌素、達(dá)托霉素)，免疫抑制劑(環(huán)抱霉素A)和抗腫瘤藥物(博來霉素)。尿苷肽抗生素(比如Pacidamycins和Sansanmycins)對高抗藥性病原體都有良好的抗菌活性，是具有底物寬泛性的NRPSs的組裝產(chǎn)物。
Grüschow等發(fā)現(xiàn)Pacidamycin的生物合成途徑對大部分Tryptophan類似物具有底物寬泛性，從而可以獲得新的Pacidamycin衍生物。
2、酶水平組合生物合成
2.1整個結(jié)構(gòu)域及模塊和亞基的交換
交換整個結(jié)構(gòu)域、模塊和亞基是組合生物合成的經(jīng)典方法。模塊化PKSs和NRPSs具有模塊化組織和逐步合成策略的特點(diǎn)，適用于組合生物合成。用來自雷帕霉素mPKS的AT結(jié)構(gòu)域和β-C過程結(jié)構(gòu)域替換紅霉素mPKS的各自對應(yīng)的結(jié)構(gòu)域，可以構(gòu)建61種6-脫氧紅霉素B(6-DEB)類似物組合庫。
NRPSs模塊化途徑中GTs大部分屬于GT-B結(jié)構(gòu)超級家族，包括2個通過接頭環(huán)連接的功能域。通過交換接頭兩端的結(jié)構(gòu)域可以得到GT-B型功能性嵌合酶。Parket等利用卡那霉素GT(kanE)N-末端卡和萬古霉素GT(GtfE)的C-末端之間的不同交叉點(diǎn)，構(gòu)建了1個嵌合酶庫。交換功能性結(jié)構(gòu)域的GT(HMT31)能夠催化合成2-DOS衍生物。通過交換替考拉寧和Chloroeremomycin的GTs的N-末端和C-末端，能夠獲得2種嵌合糖基轉(zhuǎn)移酶GtfBH1和GtfBH2.嵌合酶可以改變底物特異性，從而獲得雜交糖肽類抗生素。
2.2定點(diǎn)誘變和定向進(jìn)化
傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域交換常導(dǎo)致蛋白不溶性表達(dá)，活性受到破壞，產(chǎn)量降低�，F(xiàn)代蛋白質(zhì)工程，比如定點(diǎn)突變替換特定的氨基酸，可以更高效地改變酶的功能。ChristopherD.Reeves等將6-DeoxyerythronolideB合成酶(DEBS)模塊4中乙酰轉(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域的3個不同的負(fù)責(zé)特異性的主要區(qū)域，突變成丙二酰-CoA-特異結(jié)構(gòu)域中的序列。發(fā)現(xiàn)單個區(qū)域突變或者3個區(qū)域全部突變可以得到功能性DEBSs,該DEBSs能夠產(chǎn)生天然聚酮類混合物(6-DeoxyerythronolideB,新的類似物和6-Desmethyl-6-deoxyerythronolideB)。這表明識別序列決定AT的特異性，DEBS能夠在模塊4中摻入丙二酸單元得到新的聚酮鏈。定向進(jìn)化可以應(yīng)用于定向改善酶的特性及闡述催化機(jī)制。
3、途徑水平組合生物合成
隨著分子合成生物技術(shù)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了在特征宿主微生物中異源表達(dá)來自于不同屬的基因。從1985年開始，雜交途徑廣泛應(yīng)用于獲取新的天然產(chǎn)物，尤其是藥物研發(fā)領(lǐng)域。糖基在藥物靶向作用中起著重要作用，糖基化能夠顯著地影響藥物的溶解性和生物活性。大量的新型糖基化產(chǎn)物的產(chǎn)生，為藥物研發(fā)提供了機(jī)遇。糖基化聚酮類化合物Mithramycin能與DNA結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄過程和蛋白合成。常用于治療多種癌癥，高鈣血癥和高鈣尿癥。但是它有致命的'副作用，被限制用于臨床。
Nú觡ez等在突變株S.argillaceusM3W1中表達(dá)含有糖基化NDP-D-洋地黃毒素糖合酶的質(zhì)粒，獲得改變糖鏈或同時改變糖鏈和3-位側(cè)鏈的7種Mithramycin類似物。得到的Demycarosyl-3D-β-D-digitoxosyl-mithramycinSK比Mithramycin具有更高的抗腫瘤活性，毒性更低。
4、挑戰(zhàn)與前景
組合生物學(xué)利用合成途徑改組技術(shù)獲得了突變的天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物，使傳統(tǒng)合成領(lǐng)域發(fā)生了根本變化，在新藥開發(fā)過程中也發(fā)揮著重要作用。采用酶工程，合適的表達(dá)宿主和代謝工程可以解決產(chǎn)量低的“瓶頸”.
另外，藥物開發(fā)需要龐大的化合物庫，新的快速DNA合成和組裝技術(shù)可以解決傳統(tǒng)克隆對工程化生物催化和組合生物學(xué)產(chǎn)物的通量的限制。因此，急需高通量篩選方法篩選大量候選化合物。用計(jì)算機(jī)方法結(jié)合結(jié)構(gòu)-生物活性分析進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，以確保獲得所需的活性。
結(jié)構(gòu)域或模塊交換方法面臨的挑戰(zhàn)是嵌合合成的產(chǎn)物不溶性表達(dá)或者功能受損。由于目前對蛋白折疊動力學(xué)的理解不完整，并且能量平臺模式也存在問題，因此需要計(jì)算機(jī)工具來精確預(yù)測蛋白構(gòu)型以及結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域和模塊-模塊之間的相互作用。另外，許多藥物生物活性的分子機(jī)制研究并不透徹，比如還不清楚糖基團(tuán)與活性之間的關(guān)系。為了充分利用組合生物合成，必須更好地理解關(guān)鍵酶的動力學(xué)和機(jī)制以及代謝途徑。
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