高效液相色譜法測定苯扎貝特中的有關物質
摘 要：目的：對采用高效液相色譜法測定苯扎貝特當中的有關物質進行研究。方法：USKH071233C18：甲醇=4：6，流動相是磷酸二氫鉀溶液，在檢測的過程中，檢測波長度為228nm，流速為1.0ml/min。結果苯扎貝特和五種主要的雜質都能取得良好的分離效果。結論：這種測定方法在應用的過程中能夠體現(xiàn)出非常高的靈敏度和準確度，因此這種方法也可以應用在苯扎貝特有關物質含量的控制和測定當中。
關鍵詞：苯扎貝特;系統(tǒng)適用性;有關物質
苯扎貝特是一種氯貝丁酸衍生物類的血脂調節(jié)類藥物，在降血脂方面，其具備兩種機制：首先是提高脂蛋白脂酶和肝脂酶的活性，這樣也就使得低濃度的蛋白可以更加迅速的完成分解和代謝功能，從而使得上血甘油三脂的水平出現(xiàn)了非常明顯的下降現(xiàn)象，從而也就使得基底密度的脂蛋白分泌量出現(xiàn)非常顯著的減少現(xiàn)象，從而也就十分有效的降低了血低密度蛋白酶的量以及膽固醇的水平，在生產(chǎn)的過程中可能會出現(xiàn)一定的雜質，所以我們需要對其進行測定和分離，保證藥物的藥效。
一、儀器與試藥
高效液相色譜儀系統(tǒng)：Agilent 1200檢測器： Agilent 1200分離單元(四元泵、自動進樣器、柱溫箱);軟件：安捷倫工作站;HP1020打印機。苯扎貝特EP標準品(lot：n0.1.a);甲醇(色譜純04020-3，OCEANPAK ALEXATIVE CHEMLCAL);雜質A(lot：20061116，含量：99.8%中間體);雜質B(lot：T20060919，含量：100%國藥集團化學試劑有限公司)，雜質C(lot：20061101，含量：99.6%自制)，雜質D(lot：20061101，含量：99.5%自制)，雜質E(lot：20070226，含量：99.5%自制)。
二、方法與結果
2.1 色譜條件
色譜柱： USKH071233C18(5um)0.125m×4mm。流速為1ml/min;檢測波長為228nm。流動相：磷酸二氫鉀溶液(2.72g/L，用磷酸調節(jié)PH2.3)：甲醇=4：6;進樣量：20ul。
2.2 溶液制備
供試樣品溶液：精確稱取該品50mg，將其放置在容積為100ml的容量瓶當中，加入一定的流動相，采用超聲波的方式使其溶解，將其靜置直至其溫度達到室溫的水平。用流動相稀釋到刻度的位置，將其混合均勻之后配制成0.5mg/ml的溶液。對照品溶液(a)精確量取供試品溶液10ml，加入流動相之后將其放入到容積為100ml的容量瓶當中，稀釋到刻度的位置。再吸出5.0ml的上述溶液，加入適量的流動相，使其稀釋到100ml。對照品溶液(b)：精確吸取對照品溶液(a)5.0ml，加入適量的流動相將其稀釋到50.0ml即完成了對照品溶液(b)的配制。對照品溶液(c)：精確量取1ml的試驗溶液和1ml濃度為1mol/L的鹽酸溶液，和其充分的混合之后，在電熱板上進行加熱處理，直至蒸干。殘渣使用流動相進行溶解處理，同時壞要將其稀釋到20ml。
2.3 系統(tǒng)適應性試驗
系統(tǒng)在運行的過程中達到相對平衡的狀態(tài)之后，根據(jù)上述的'色譜條件精確量取對照溶液(a)20μl進行進樣處理，對系統(tǒng)的靈敏度進行適當?shù)恼{整，從而使得主峰的高度占到記錄儀最大刻度的5成以上，連續(xù)進樣5次，從而得到苯扎貝特峰計算的理論塔板數(shù)N=3916，峰面積RSD=1.0%，在2.0%以內。之后再精確的量取對照溶液(c)20μl進行進樣處理，對這一過程中的色譜圖進行全面的記錄。在記錄對照液(c)的色譜圖過程中，兩個主峰分離度達到了5.0以上。在對對照液(b)的色譜圖進行記錄的過程中發(fā)現(xiàn)色譜圖當中的信噪至少是5。
空白測試：取適量的流動相進行進樣處理，作為容積空白，這也充分的標明流動相對雜質的測定并不會產(chǎn)生負面的影響，樣品測定過程中的溶劑峰可以忽略不計。
2.4 方法的專屬性
2.4.1 結構確認(委托中國藥科大學檢測)：經(jīng)紅外光譜，核磁共振，質譜等結構解析確證各雜質的結構。
2.4.2 單個雜質的定性。依次取“2.7線性關系項下雜質標準貯備液”(雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E和雜質F)1.0mL，各至一個50mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混合均勻。每個溶液分別進樣，記錄各組分的保留時間，用保留時間對每個雜質進行定性。
2.5 破壞性試驗
精密稱取樣品細粉10mg，將其放入到容積為10ml的容量瓶當中，將其平均分成5份，對其分別進行高溫、光照、強酸、強堿和強氧化等破壞性試驗，使用流動相將其稀釋成濃度為1mg/ml的溶液，分別對其進行進樣測定。測定之后發(fā)現(xiàn)所有破壞條件下降解產(chǎn)物和主成分峰分離的效果非常好。
2.6 精密度和重復性
在重復性和中間精密度測試項之下，標準溶液連續(xù)進行6次進樣處理，各組分的峰面積RSD都在2.0%之內，重復性和中間的密度并沒有非常明顯的差異。
2.7 線性關系考察
雜質的標準儲備液：分別嚴格按照要求去稱取以下標準品：分別精密稱取以下標準品：雜質A～E和苯扎貝特10.0mg，各至一個25ml容量瓶中，各加入流動相溶解并稀釋至刻度，混合均勻，得到每個雜質的標準貯備液。每個雜質的濃度均約為400ug/ml。雜質標準儲備溶液(a)分別量取雜質標準儲備溶液5.0ml，將其放入到容積為100.0ml的容量瓶當中，使用適量的流動相將其稀釋到刻度的位置，同時還要進行搖勻處理。各雜質和苯扎貝特的濃度為20μg/ml。
雜質線性標準溶液：分別取雜質標準貯備溶液(a)0.5ml，1.0ml，2.5ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，8.0ml各至一個50.0ml容量瓶，用流動相稀釋至刻度，混合均勻，得到No.1～No.7線性標準溶液。各雜質及苯扎貝特的濃度范圍為0.2～3.2ug/ml，相當于雜質及苯扎貝特含量0.02%～0.32%。測定：分別取No.1～No.7線性標準溶液，分別進樣，每個濃度連續(xù)進3次，記錄色譜圖。以各組分峰面積平均值對其濃度(ug/ml)，使用origin5.0軟件進行線性回歸，得到各組分的標準曲線。在線性測試項下各組分峰面積與溶液的濃度均成線性關系，且相關系數(shù)r均大于0.999，該方法的線性關系良好。
2.8 回收率
以中間精密度項下5號現(xiàn)象標準溶液為主要標準，按照其特定的公式來對回收率進行統(tǒng)計，同時還要計算出平均的回收率。在回收率測試項當中，各個組分在不同濃度下不同雜質的平均回收率都處在了85.0%-115.0%之間。
2.9 雜質檢測限、定量限的測定
在色譜系統(tǒng)下進樣，記錄色譜圖。當待測組分的信噪比為2～3倍時，對應的濃度為該組分的最小檢測濃度(Cm1);當待測組分的信噪比為10～20倍時，對應的濃度為該組分的最小定量濃度(Cm2)。所有測定雜質的檢測限結果范圍從0.001%～0.002%，定量限結果范圍從0.002%～0.02%;其它未知雜質的檢測限和定量限以苯扎貝特進行評價，依次為0.001%和0.002%。
2.10 樣品的穩(wěn)定性
取0.5mg・mL-1樣品溶液分別于0、5、10、20、30和50h進樣測定。結果表明，樣品放置室溫下，2天穩(wěn)定性良好。
2.11 樣品有關物質測定�？瞻诇y試：取流動相20μL進樣，記錄色譜圖。在樣品的測試中忽略溶劑峰。取樣品溶液20μL進樣，記錄色譜圖。樣品雜質含量測定結果符合規(guī)定。
三、討論
在本實驗當中，研究人員采用的是高效液相色譜法對相關物質進行測定，這種方法能夠有效的對苯扎貝特的主成分，中間體和分離產(chǎn)物進行分離處理，這種方法操作便捷，同時還具備非常強的專屬性。這種方法在很廣泛的范圍之內都能體現(xiàn)出較好的檢測靈敏度，同時還能對中間體和其他雜質進行全面的檢查，具有非常強的優(yōu)越性。
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