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種子蛋白電泳技術(shù)
【摘要】：種子蛋白電泳是指通過(guò)特定的電泳方法對(duì)種子蛋白進(jìn)行分離和鑒別的一種技術(shù)，最常用的是酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳（A-PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。聚丙烯酰胺凝膠電泳作為一種高分辨率的分析鑒定技術(shù)，在蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子的分析中一直廣泛使用，通過(guò)種子蛋白電泳獲得的指紋圖譜在測(cè)定良種質(zhì)量（真?zhèn)�、純度）防止偽劣種子流入，保護(hù)我國(guó)名、優(yōu)、特種質(zhì)資源及育成的知識(shí)產(chǎn)權(quán)和育種家們的權(quán)益等方面，均具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：種子蛋白；凝膠電泳
1種子蛋白質(zhì)的分類(lèi)
種子蛋白質(zhì)分為兩大類(lèi)：貯藏蛋白質(zhì)和“家政”蛋白質(zhì)。貯藏蛋白質(zhì)是種子蛋白質(zhì)的主要成份，它在種子形成發(fā)育時(shí)期大量合成和積累；在種子萌發(fā)時(shí)，它又很快被水解并為幼苗早期生長(zhǎng)提供還原性的氮源�！凹艺钡鞍踪|(zhì)在種子中的含量較少，但對(duì)于維持種子的正常代謝活動(dòng)卻是必不可少的。通常根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性，將種子貯藏蛋白質(zhì)分為4類(lèi)：溶于水的清蛋白、溶于鹽溶液的球蛋白、溶于醇溶液的醇溶蛋白和溶于酸或堿的谷蛋白。
2電泳技術(shù)簡(jiǎn)介
電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們?cè)谀硞�(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。
電泳按其分離的原理不同可分為：早期的自由界面電泳、應(yīng)用最廣泛的區(qū)帶電泳、等速電泳、等電聚焦電泳等。作為品種鑒定的一種快速有效的方法，在20世紀(jì)70年代初期，許多科學(xué)家和種子分析人員就開(kāi)始通過(guò)能夠鑒別生物個(gè)體之間差異的電泳圖譜測(cè)定品種間的遺傳差異。最初采用同工酶電泳技術(shù)，80年代以后電泳方法不斷改進(jìn)才逐漸采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，特別是蛋白質(zhì)電泳因其具有的良好穩(wěn)定性和重復(fù)性顯示出巨大的使用價(jià)值。蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜包括同工酶和貯藏蛋白，這些蛋白的組成由遺傳決定，幾乎不受影響，其組分差別反映出基因型的不同，且產(chǎn)生的指紋圖譜分辨率高、重復(fù)性好，因而被作為品種鑒別與分類(lèi)的“指紋”得到廣泛應(yīng)用。
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3聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)
聚丙烯酰胺凝膠電泳是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術(shù)，是生化物質(zhì)的最高純度的標(biāo)準(zhǔn)分析鑒定方法，至今仍被人們稱(chēng)為是對(duì)生物大分子進(jìn)行分析鑒定的最后、最準(zhǔn)確的手段。種子蛋白電泳就是采用聚丙烯酰胺做為支持介質(zhì)的電泳技術(shù)。
聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過(guò)改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來(lái)控制，可以隨意控制膠濃度“T”和交聯(lián)度“C”得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子，大大增加了凝膠的分離范圍。同時(shí)聚丙烯酰胺凝膠還具有化學(xué)惰性好不會(huì)出現(xiàn)“電滲”、電泳分離的重復(fù)性好、膠體透明度高易于拍照、強(qiáng)度好易于保存、無(wú)紫外吸收等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用目前尚無(wú)更好的支持介質(zhì)能夠取代它。
種子蛋白大多帶正電荷，因而種子蛋白電泳過(guò)程中常采用酸性不連續(xù)性聚丙烯酰胺凝膠電泳（A-PAGE）的方法，讓帶電基團(tuán)向正極泳動(dòng)，通過(guò)凝膠的濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，對(duì)蛋白進(jìn)行分離。也可采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），SDS-PAGE是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉）， SDS是一種陰離子去垢劑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成SDS -蛋白質(zhì)復(fù)合物。由于SDS帶有大量負(fù)電荷，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋，消除了蛋白質(zhì)分子之間電荷差異。因此在電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)分子大小，此法常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。
對(duì)種子蛋白進(jìn)行電泳分離主要目的是為了鑒別種子的真實(shí)性和品種純度，具體方法可參考標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)實(shí)際情況稍做改進(jìn)。酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳中常采用甲酸鹽緩沖體系和乳酸鹽緩沖體系，分離膠的pH值在2.7-3.2之間，電極緩沖液的pH值在3.25-3.65之間，慢離子多為甘氨酸濃度在0.040~0.053 mol/L之間。至于凝膠濃度的確定，不同的貯藏蛋白分子量大小不同所需的凝膠孔徑也有差異，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中調(diào)整膠濃度大小通過(guò)電泳結(jié)果選擇合適的濃度。
品種純度是農(nóng)作物種子質(zhì)量指標(biāo)中最關(guān)鍵的一項(xiàng)，是對(duì)種子質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)的唯一指標(biāo)。隨著草坪業(yè)的發(fā)展速度日益加快，草坪種子目前以成為世界僅次于禾谷類(lèi)種子的第二大交易種子。為防止偽劣種子流入同時(shí)保護(hù)優(yōu)良種質(zhì)防止良種退化，維護(hù)育種家們的知識(shí)產(chǎn)權(quán)和權(quán)益等方面，無(wú)論是在農(nóng)作物還是在草坪草都需要進(jìn)行品種鑒定，種子蛋白電泳技術(shù)一直在品種鑒定工作中發(fā)揮這重要的作用，具有重要的意義。
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